肿瘤防治研究  2014, Vol. 42 Issue (1): 9-13
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管,湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
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文章信息

杨熹,李海杰,李国东,傅寅佳,罗学来,龚建平,胡俊波. 2015.
YANG Xi, LI Haijie, LI Guodong, FU Yinjia, LUO Xuelai, GONG Jianping, HU Junbo. 2015.
增殖细胞核抗原与p55PIK结合调控乳腺癌细胞MCF7增殖的研究
p55PIK Combined with Proliferating Cell Nuclear Antigen Promote Proliferation of Breast Cancer Cells MCF7
肿瘤防治研究, 2015, 42(01): 9-13
Cancer Research on Prevention and Treatment, 2015, 42(02): 9-13
http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2015.01.003

文章历史

收稿日期:2013-12-25
修回日期:2014-07-04
增殖细胞核抗原与p55PIK结合调控乳腺癌细胞MCF7增殖的研究
杨熹, 李海杰, 李国东, 傅寅佳, 罗学来, 龚建平, 胡俊波    
430030 武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤研究所,胃肠外科
摘要目的 观察p55PIK对乳腺癌细胞MCF7细胞周期及增殖的影响,并探讨其可能的机制。方法通过转染质粒或特异性siRNA,在乳腺癌MCF7细胞中过表达或低表达p55PIK,继而通过免疫印迹法检测p55PIK的表达,通过BrdU/PI双掺入法测定细胞DNA合成及细胞周期,并用CCK-8(cellcounting kit-8)试剂盒检测细胞增殖,最后通过免疫共沉淀技术检测明确p55PIK是否可以与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)相结合。 结果 p55PIK过表达质粒及siRNA可分别使MCF7细胞中p55PIK成功过表达或低表达,而且过表达p55PIK可加快MCF7细胞的DNA合成,p55PIK组[DNA合成比率为(56.33±1.63)%]与Vector组[DNA合成比率为(26.27±1.85)%]比较差异有统计学意义(P<0.01),过表达5PIK促进MCF7细胞从G0/G1期进入S期,从而调节其增殖,p55PIK组[OD450nm:(1.46±0.04)]与Vector组[OD450nm:(1.16±0.16)]比较差异有统计学意义(P<0.05),而低表达p55PIK可抑制上述过程。免疫共沉淀证实p55PIK与PCNA之间可以相结合。 结论 p55PIK可促进乳腺癌细胞MCF7细胞周期进程及增殖,而且p55PIK可与PCNA相结合。
关键词p55PIK     细胞周期     增殖     乳腺癌     增殖细胞核抗原    
p55PIK Combined with Proliferating Cell Nuclear Antigen Promote Proliferation of Breast Cancer Cells MCF7
YANG Xi, LI Haijie, LI Guodong, FU Yinjia, LUO Xuelai, GONG Jianping, HU Junbo    
Cancer Research Institute, Department of General Surgery, Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
AbstractObjective To investigate the effect of p55PIK on cell cycle and proliferation of breast cancer cells MCF7, and the potential mechanism. Methods Breast cancer cells MCF7 were transfected with plasmids or specific siRNA for over-expression or low-expression of p55PIK. Then p55PIK expression was detected by Western blot. Cell cycle and DNA synthesis were measured through BrdU/PI. Meanwhile, Cell Counting Kit-8(CCK-8) assay was performed to detect the proliferation of breast cancer cells MCF7, and a co-immunoprecipitation assay was conducted to find out whether p55PIK could bind with proliferating cell nuclear antigen(PCNA). Results p55PIK was successfully up-regulated or down-regulated after transfection. p55PIK overexpression could promote DNA synthesis and the proliferation of breast cancer MCF7 cells [DNA synthesis by BrdU: p55PIK vs. Vector, (56.33±1.63)% vs. (26.27±1.85)%, P<0.01; CCK-8 at OD450nm: p55PIK vs. Vector, (1.46±0.04) vs. (1.16±0.16), P<0.05). Meanwhile, down-regulation of p55PIK could inhibit cell cycle and the proliferation of breast cancer cells MCF7. p55PIK could combine with PCNA. Conclusion p55PIK could promote cell cycle progress and the proliferation of breast cancer cells MCF7. Moreover, p55PIK could combine with PCNA.
Key words: p55PIK     Cell cycle     Proliferation     Breast cancer     Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)    
0 引言

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI 3K)是调控细胞生长、增殖、分化、凋亡及糖脂代谢等功能的重要蛋白,是由催化亚基和调节亚基组成的异二聚体[1,2,3]。p55PIK作为PI3K不可或缺的调节亚基之一,近年来研究证实其可以参与调控结肠癌细胞增殖、血管形成及白血病分化等一系列生物学进程,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[4,5]。但p55PIK是否也可以调控乳腺癌细胞的细胞周期及增殖,及其中的具体机制尚不清楚,本文利用p55PIK过表达质粒转染乳腺癌细胞系MCF7,观察其对MCF7细胞周期及增殖的影响,并利用免疫共沉淀证实p55PIK可以与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)相结合。 1 材料与方法 1.1 细胞系及试剂

人乳腺癌细胞株MCF7由华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤研究所(以下简称“本研究所”)传代培养。DMEM培养液购自武汉博士德生物公司,转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司,p55PIK特异性siRNA由本研究所设计、广州锐博生物公司合成,p55PIK过表达质粒由本研究所既往构建保存至今;小鼠抗人p55PIK单克隆抗体、小鼠抗人PCNA单克隆抗体及小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)单克隆抗体等均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司,Westernblot实验所使用试剂及检测增殖的CCK-8(cell countingkit-8)试剂盒购自江苏碧云天生物公司。1.2 细胞培养

采用含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液,在37℃、5%CO2的培养箱中培养,用含0.25%胰蛋白酶、0.05%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化传代。1.3 质粒及siRNA转染

根据Invitrogen公司Lipofectamine 2000转染操作指南按照每孔4 μg质粒DNA或10 μmol/L的剂量与Lipofectamine2000每孔5 μl进行转染。实验分为空白对照组(Blank)、空质粒对照组(Vector)、过表达p55PIK组(p55PIK)、siRNA对照组(siRNANC)和siRNA-p55PIK组(siRNA-p55PIK)。 1.4 Westernblot检测MCF7细胞中p55PIK蛋白的表达

用胰酶消化细胞,并用PBS洗涤,加入NP-40裂解后,吸取上清液则为细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白质浓度,加入适量的SDS上样缓冲液,采用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜。用脱脂牛奶封闭分别孵育p55PIK及GAPDH一抗、二抗,ECL化学发光显影。1.5 BrdU/PI双掺入法测定细胞DNA合成及细胞周期

MCF7细胞掺入BrdU(10 μmol/L)30min后,PBS漂洗,75%冰乙醇固定过夜后,2M盐酸破膜打孔40min,0.1M四氢硼砂中和,并依次孵育BrdU一抗、二抗及PI后行流式细胞仪检测。1.6 CCK-8试剂盒检测细胞增殖

将MCF7细胞以每孔2000个细胞的密度接种于96孔板,按照上述步骤转染p55PIK过表达质粒或siRNA后,分别于24、48及72h后按照CCK-8试剂盒说明书操作,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,继续孵育4h后,在450nm测定吸光度。1.7 免疫共沉淀

收集大约1×107个MCF7细胞,常规获取细胞总蛋白,并取出100 μl冻存作为细胞总裂解液(wholecelllysate,WCL),其余分为等量3份,分别加入p55PIK一抗(anti-p55PIK)、PCNA一抗(anti-PCNA)及IgG后4℃旋转过夜,再加入ProteinA/G-Agarose旋转1h,洗涤后加入适量SDS上样缓冲液100℃水浴10min,12000r/min离心后取上清液作为IP样品,与WCL一起行Westernblot检测。1.8 细胞免疫组织化学

将MCF7细胞经过细胞爬片种植于无菌盖玻片上,按照常规免疫组织化学依次分别孵育p55PIK及PCNA的一抗、二抗后,DAB染色并拍照。1.9 统计学方法

应用SPSS软件进行统计分析,计量资料以x±s表示,两组均数的比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 在MCF7细胞中成功过表达或低表达p55PIK

在MCF7细胞中转染p55PIK过表达质粒24h,可显著增加其p55PIK蛋白水平的表达,见图 1A;转染p55PIK特异性siRNA72h后可显著降低p55PIK的蛋白表达,见图 1B。而转染对Vector或siRNA-NC组中p55PIK的蛋白表达没有明显的影响,见图 1

A: p55PIK was overexpressed by plasmid transfestion in MCF7 cells; B: p55PIK was lowexpressed by specific siRNA transfection in MCF7 cells; 1:blank; 2:Vector; 3:p55PIK; 4:siRNA-NC; 5:siRNA-p55PIK 图 1 MCF7细胞中p55PIK过表达质粒及特异性siRNA的有效性 (n=3) Figure 1 The efficiency of p55PIK overexpression plasmid and specific siRNA in MCF7 cells (n=3)
2.2 p55PIK对MCF7中DNA合成的影响

转染p55PIK过表达质粒24h或转染siRNA72h后,按照1.5步骤行BrdU/PI双掺入法检测MCF7细胞DNA合成。过表达p55PIK可显著增加其BrdU阳性细胞数,即DNA合成增加,见图 2A。Blank组(25.65±1.98)%、Vector组(26.27±1.85)%、p55PIK组(56.33±1.63)%,p55PIK组与Vector组之间差异有统计学意义(P<0.01),见图 2C;而低表达p55PIK可显著减低其BrdU阳性细胞数,即DNA合成减少,见图 2B。Blank组(24.98±4.18)%、siRNA-NC组(25.90±1.28)%、siRNAp55PIK组(12.80±1.67)%,siRNA-p55PIK组与siRNA-NC组之间差异有统计学意义(P=0.038)见图 2D。而Vector及siRNA-NC两个阴性对照组与Blank组之间比较差异无统计学意义(P=0.67)。通过PI标记细胞周期,过表达p55PIK可促进MCF7细胞从G0/G1期进入S期,见图 3 A,而低表达p55PIK可导致MCF7细胞发生G0/G1期阻滞,见图 3B。

A: p55PIK over-expression promoted DNA synthesis of MCF7 cells; B: p55PIK low-expression inhibited DNA synthesis of MCF7 cells; C and D were the histograms of A and B,respectively; *: P<0.05,**: P<0.01 图 2 p55PIK对MCF7细胞DNA合成的影响 (n=3) Figure 2 The effect of p55PIK on DNA synthesis in MCF7 cells (n=3)
A: p55PIK over-expression promoted cell cycle of MCF7 cells; B: p55PIK low-expression inhibited cell cycle of MCF7 cells 图 3 p55PIK对MCF7细胞周期的影响 (n=3) Figure 3 The effect of p55PIK on cell cycle of MCF7 cells (n=3)
2.3 p55PIK对MCF7细胞增殖的影响

转染p55PIK过表达质粒24h或转染siRNA72h后,按照上述步骤CCK-8法检测MCF7细胞增殖。过表达p55PIK可促进MCF7细胞增殖,OD450nm:Blank组(1.08±0.06)、Vector组(1.16±0.16)、p55PIK组(1.46±0.04),p55PIK组与Vector组之间比较差异有统计学意义(P=0.029),见图 4A。而低表达p55PIK抑制其增殖,OD450nm:Blank组(1.10±0.08)、siRNA-NC组(1.07±0.16)、siRNA-p55PIK组(0.68±0.04),p55PIK组与s iRNA- NC组之间比较差异有统计学意义(P=0.031)。而Vector及siRNA-NC组与Blank组之间比较差异无统计学意义(P=0.54),见图 4B。

A: p55PIK over-expression promoted cell proliferation of MCF7 cells; B: p55PIK low-expression inhibited cell proliferation of MCF7 cells; *: P<0.05,compared with Vector group; #: P<0.05,compared with siRNA-p55PIK group图 4 p55PIK对MCF7细胞增殖的影响 (n=3) Figure 4 The effect of p55PIK on cell proliferation of MCF7 cells (n=3)
2.4 p55PIK可与PCNA相结合

anti-p55PIK及anti-PCNA与WCL相比,可以分别使p55PIK及PCNA浓聚,而且分别在anti-p55PIK组样品中检测到PCNA,在anti-PCNA样品中检测到p55PIK,而在IgG阴性对照组中没有检测到相应的条带,从而证实p55PIK可与PCNA直接结合,见图 5A,同时细胞免疫组织化学也证实p55PIK及PCNA两种蛋白均主要定位于细胞核中,从侧面证实两者的结合发生于细胞核内,见图 5B。

WCL: whole cell lysate; A: the combination of p55PIK with PCNA was detected by IP; B: the location of p55PIK and PCNA was measured by IHC; 1: anti-p55PIK; 2: anti-PCNA图 5 p55PIK影响增殖的具体机制 (n=3) Figure 5 The mechanism of p55PIK regulating cell proliferation (n=3)
3 讨论

近年来我国乳腺癌的发病率逐年上升,目前已居女性恶性肿瘤发病率首位[6]。乳腺癌作为一种常见的恶性肿瘤,其发病是多种癌基因异常激活及抑癌基因失活共同作用的结果,多条信号通路的异常状态参与其中,其中PI3K信号通路的持续性激活被认为在乳腺癌的病理过程中扮演重要作用[7,8]。p55PIK作为PI3K重要的调节亚基,除了与其他调节亚基一样,可以通过调控催化亚基的活性、影响催化亚基的亚细胞定位等方式,调节PI3K通路活性外,还可以绕过PI3K下游经典的蛋白激酶B通路发挥其独特的细胞生物学功能[9]

我们前期研究发现p55PIK作为PI3K的调节亚基,在人恶性肿瘤细胞核中有很强的表达,更重要的是我们发现p55PIK可以通过Toll样受体途径调控CD11b及CD14等白血病细胞因子的表达,与全反式维甲酸联用可显著调节人白血病细胞的细胞周期进程和分化水平,而该过程并不依赖于经典的蛋白激酶B的活性[4]。我们证实了在结直肠癌中,p55PIK可以通过激活NF-κB信号通路,从而促进乏氧诱导因子的表达,进而促进结直肠癌的血管生成[5]。这些结果提示,p55PIK下游存在PI3K非经典途径,即非蛋白激酶B途径。但p55PIK调节细胞增殖具体的作用机制尚不清楚。而本研究表明,p55PIK可以与胞核中重要的细胞周期调节蛋白PCNA相结合。PCNA是与细胞DNA合成密切相关的蛋白,一般认为主要表达于增殖细胞或者肿瘤细胞中,PCNA的表达率可以一定程度上反映肿瘤的DNA合成速率和增殖状态,p55PIK与PCNA相结合,提示p55PIK有可能通过调控PCNA的蛋白表达或者影响其功能,从而增快MCF7细胞周期进展,促进MCF7细胞的增殖,有利于进一步完善明确乳腺癌中复杂的信号通路,为药物治疗提供新的可能的靶点。

p55PIK是PI3K家族中重要的调节亚基,而PI 3K作为细胞不可或缺的管家蛋白,不仅对肿瘤的增殖、分化、凋亡及侵袭转移等功能有重要的调节作用,也参与细胞的糖代谢、脂代谢及自噬、衰老等正常的生物学进程,所以PI3K的全通路抑制剂往往因较大的不良反应而限制其临床应用。而我们设计合成了针对p55PIK的特异性抑制多肽,可明显抑制肿瘤细胞增殖,促进白血病细胞分化,且基本不影响正常细胞的糖脂代谢[4,10],而我们将进一步通过体内外实验明确p55PIK的特异性抑制多肽在乳腺癌中的作用,希望将之开发成为临床抑瘤药物。

参考文献
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