肺癌是当今全球发病率和死亡率均很高的一 种恶性肿瘤，非小细胞肺癌（NSCLC）占原发性 支气管肺癌发病数的80%以上，居恶性肿瘤死因 首位^[1]。目前，肺癌的5年生存率仍低于15%^[1]， 具有相同临床特征的不同个体在预后结局等方面 常存在较大差异^[2,3,4,5,6]。DNA双链断裂修复（double strand breaks repair，DSBR）基因对保持细胞和机 体的存活起着至关重要的作用^[4]，DNA修复基因的 多态性可改变基因的表达和活性，影响个体损伤 DNA的修复能力，从而影响肿瘤患者的疗效和预 后。DSBR基因遗传多态性显著影响肺癌的发病风 险^[7,8]，但与生存结局的关联研究甚少。本课题组 前期探讨了DSBR基因的rs6869366、rs1056503、 rs3734091、rs861539、rs861537、rs1799794、 rs16942、rs144848、rs1805794、rs2735383与肺癌 易感性的关联^[7,9]，本研究将进一步探讨其多态性 与NSCLC预后的关联，为临床诊治和患者预后评 估提供参考。 1 资料与方法 1.1 病例资料

收集福建医科大学附属第一医院、福建医科 大学附属协和医院、南京军区福州总院2006年12 月至2010年1月NSCLC病例679例。纳入标准： （1）经纤维支气管镜或手术取得组织病理、脱落 细胞学确诊的NSCLC病例；（2）原发性NSCLC 新发病例；（3）确诊时未经历过化疗或放射治 疗者；（4）在福建本地居住10年以上。排除标 准：（1）继发性肺癌患者；（2）病情危重或不 能清晰回答问题者；（3）不愿配合问卷调查者； （4）不愿提供联系方式、身份证号码及不愿配 合随访的患者。对每位新发病例在治疗前采用 EDTA-2K抗凝管采集外周静脉血5 ml，2 000 r/min 离心10 min，分装后置-80℃超低温冰箱冻存。本 研究通过了福建医科大学伦理委员会审批，研究 对象均签署了书面知情同意书。 1.2 随访

患者的一般人口学资料、肿瘤临床资料、治 疗情况、吸烟史等信息采用统一编制的调查表， 由经过统一培训的调查员面访、查阅病案资料收 集。病例确诊后每半年随访一次，随访截止日期 为2013年5月10日，中位随访期为27月(0~77月)。 采用电话随访为主，通过电话随访与患者或其家 属交流，进一步核实患者生存状态及临床治疗 信息。如果出现无法接通、关机、电话欠费等情 况，间隔数天继续电话随访，三次无法联系到患 者或其家属则通过省疾控死亡登记系统或患者身 份证号码到公安局查证患者的生存结局，查不到 者根据末次电话随访到的时间，或病案室收集到 的末次出院时间作为其截止时间。 1.3 标签SNP的选择

应用HapMap计划（http://www.hapmap.org/） 的通用基因组浏览器（HapMap Genome Browser） 获得中国人群SNP基因型数据，运行Haploview 4.2 软件，设置最小等位基因频率（MAF）的界值为 0.10，r²>0.8，选择具有潜在功能SNPs进行分析。 1.4 基因分型

采用DNAzol试剂（北京百泰克生物技术有 限公司产品）提取基因组DNA，紫外分光光度 法(OD₂₆₀/OD₂₈₀比值)测定DNA的纯度，OD₂₆₀测定 DNA的浓度。应用TaqMan探针基因分型技术和 ABI-7500荧光定量PCR仪进行rs3734091的基因分 型，基因分型检测试剂盒（包含引物和探针）购 于ABI公司。PCR反应体系为10 ng DNA/10 μl，反 应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃ 退火复性1 min，共40个循环。根据PCR扩增后荧 光信号的种类判断基因型。采用聚合酶链反应-限 制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术进行其余 9个位点的基因分型，引物由上海生工生物工程有 限公司设计合成。PCR反应体系均为25 μl，其中 模板DNA 1 μl，上下游引物各1 μl（10 μmol/L）， ddH2O 9.5 μl，PCR MIX（北京天根科技有限公 司）12.5 μl。PCR反应条件：94℃预变性5 min， 94℃变性30 s，55℃（58℃）退火30 s和72℃延 伸30 s，35个循环后72℃延伸10 min。取酶切产 物10 μl经琼脂糖凝胶电泳，分析基因型。 1.5 质量控制

流行病学调查采用统一制定的工作手册，培 训调查人员，统一方法和标准。所有调查表由专 人编码，并在复核无误后用Epidata3.1软件进行独 立双录入计算机。实验过程遵循实验操作规范， 防止污染和错误编号。基因检测采用盲法并随机 抽取10%的样本进行复测。 1.6 统计学方法

数据录入与分析分别采用EpiData 3.2和SPSS 18.0软件。χ²检验分析基因型频率分布差异， Kaplan-Meier法估计5年生存率和中位生存时间 （MST）。Log rank检验比较不同组间总生存 （OS）的差异。OS为确诊之日起到死亡或末次随 访的时间。采用Cox比例风险模型进行预后影响 因素的单因素分析和多因素分析，计算调整HR和 95%CI。统计学检验均为双侧概率检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 患者的一般特征及总体生存的单因素分析

NSCLC 患者共679 例，其中男505 例，占 74.37%，女174例，占25.63%，男女比为：2.9:1； 最小年龄23岁，最大年龄85岁，平均年龄（58± 11.14）岁。存活219例，占32.3%；死亡460例， 占67.7%；随访成功563例，占82.92%；失访者 与未失访者的年龄、性别、临床分期、病理类 型、治疗情况等指标的比较差异无统计学意义 （P>0.05）。患者5年总生存率是29.8%（95%CI： 26.1~33.5）。单因素分析结果显示，性别、年 龄、临床分期、治疗情况与OS有显著关联（P ＜0.05），见表 1。

表 1 患者性别、年龄、病理类型、临床分期、治疗情况、吸烟量对总生存时间影响的单因素分析 Table 1 Univariate analysis of the effects of gender,age,histology,clinical stage,therapy and smoking on overall survival

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XRCC3、XRCC4、BRCA1、BRCA2、NBS1 基因10个位点的基因型分布见表 2，基因分型成功 率（CR）>98.95%，各基因型分布经检验均符合 Hardy-Weinberg平衡。

表 2 多态性位点的基因型频率及分型成功率分布 Table 2 Genotype frequencies of SNPs and the success rate of Genotyping

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分层分析显示，在化疗的病例中，携带XRCC3 rs861539 CT+TT基因型比携带CC基因型的死亡 风险降低（MST：32月 vs. 60月；HR=0.629， 95%CI：0.411~0.962，P=0.032；aHR=0.623， 95%CI：0.399~0.973，P=0.038）。鳞癌患者携 带BRCA1 rs16942 AG+GG基因型较携带AA基因 型者预后差（MST：24月vs. 31月；aHR=1.622， 95%CI：1.139~2.310，P=0.007）；在临床早期病 例中，携带XRCC3 rs861539 CT+TT基因型较携带 CC基因型的死亡风险降低（aHR=0.444，95%CI： 0.192~1.025，P=0.057），男性吸烟的早期病例携 带NBS1 rs1805794 CG+GG基因型比CC基因型的 死亡风险高（aHR=2.768，95%CI：1.273~6.017， P=0.010）。临床晚期病例携带XRCC3 rs861537 A A 基因型较携带G G 基因型的死亡风险高 （aHR=1.750，95%CI：1.021~3.001，P=0.042）。 非吸烟女性腺癌患者携带NBS1 rs2735383 GC+CC 基因型较携带GG基因型的死亡风险低（MST：41 月 vs. 32月；aHR=0.420，95%CI：0.247~0.714， P=0.001），见表 3，图 1~6。

表 3 DSBR基因SNPs与总体生存 Table 3 SNPs of DSBR gene and overall survival

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图 1 rs861539基因多态NSCLC化疗患者Kaplan-Meier生存曲线 Figure 1 Kaplan-Meier overall survival curves of NSCLC patients with rs861539 polymorphism after chemotherapy

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图 2 rs16942基因多态肺鳞癌患者Kaplan-Meier生存曲线 Figure 2 Kaplan-Meier overall survival curves of squamous cell carcinomas patients with rs16942 polymorphism

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图 3 rs861539基因多态临床早期NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲线 Figure 3 Kaplan-Meier overall survival curves of early-stage NSCLC patients with rs861539 polymorphism

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图 4 rs1805794基因多态男性吸烟临床早期NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲线 Figure 4 Kaplan-Meier overall survival curves of smoking male early-stage NSCLC patients with rs1805794 polymorphism

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图 5 rs861537基因多态晚期NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲线 Figure 5 Kaplan-Meier overall survival curves of advanced NSCLC patients with rs861537 polymorphism

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图 6 rs2735383基因多态女性非吸烟肺腺癌患者Kaplan-Meier生存曲线 Figure 6 Kaplan-Meier overall survival curves of non-smoking female adenocarcinoma patients with rs2735383 polymorphism

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根据上述分析结果，XRCC3 rs861539 CC、rs861537 AG/AA、BRCA1 rs16942 AG/GG、NBS1 rs1805794 CG/GG、rs2735383 GG基因型为不利基 因型（unfavorable genotype），携带不利基因型 患者的预后较差。把携带不利基因型数分组（≤3 个；4个；5个）评价其联合效应，并把单因素分 析中对生存期有影响的因素（性别、年龄、临床 分期、治疗方式）纳入Cox比例风险回归模型进行 多因素分析。结果显示性别、病理类型、临床分 期、治疗情况、携有不利基因数是NSCLC预后的 独立危险因素，见表 4。

表 4 患者生存期的Cox多因素分析结果 Table 4 Multivariate analysis by Cox proportional hazards model

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DNA修复基因多态性与肺癌易感性的关系被 广泛研究，而与肺癌患者生存结局的关联作用才 开始被关注。目前，DNA双链断裂修复通路与肺癌预后的关系研究较少，且结果不一致。本研究 探讨了5个DNA双链断裂修复基因10个位点多态 性及不利基因联合作用与NSCLC预后的关系。 结果显示DSBR基因位点rs861539、rs861537、 rs16942、rs1805794和rs2735383与NSCLC患者的 OS显著关联。

XRCC3蛋白不仅参与碱基切除修复，也是 DNA双链断裂同源重组（HR）路径的关键酶，参 与因电离辐射和氧自由基等诱导的DNA双链断裂 修复。本研究发现在化疗、临床早期的NSCLC患 者中，携带XRCC3第241位密码子（rs861539 ， C>T，Thr to Met）的 CT+TT基因型比携带CC基因 型死亡风险低。这与许多学者的研究结论一致， 有学者报道在用顺铂/吉西他滨治疗的NSCLC患 者中，Met等位基因是预后较好的决定因素^[10,11]。 Matullo等^[12]认为该SNP与健康者外周血白细胞的 高水平加合物相关，推测Met的转变能降低DNA的 修复能力（DRC），提高化疗患者对药物的敏感 度，从而提高化疗患者的预后。DRC是一把双刃 剑，对于未化疗的其他病例，DRC能力的降低会 增加死亡风险，如Butkiewicz等^[2]对术后NSCLC预 后研究中发现241Met/Met基因型显著增加总体死 亡风险，认为XRCC3 rs168539 T/T( Met/Met)基因 型可作为化疗NSCLC患者较易存活的生物标志。

rs1805794多态性是错义突变(Glu185Gln)，位 于乳腺癌羧基末端（BRCT）结构域，该结构域 可促进NBS1与BRCA1相互作用，并形成BRCA-1 相关基因监视复合物（BASC），该复合物负责 识别并修复受损DNA^[13,14]，Glu185Gln转变可干 扰蛋白与蛋白间的相互作用从而影响DNA修复 能力。最近一项Meta分析阐明了rs1805794多态 性与多种癌症的发生有关联^[15]，然而很少研究报 道此多态性与肺癌预后的关系。欧洲学者对258 例经铂/5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸化疗的食管癌 和胃腺癌进行研究，未发现rs1805794与上述两 种癌症的复发和OS相关。Xu等^[16]研究NBS1基因 rs1805794多态性与147例化疗的晚期NSCLC患者 临床结局关系，未发现早期NSCLC患者rs1805794 与肺癌预后相关，但发现其与无进展生存期 （PFS）具有显著关联：携带rs1805794 CC或CG 基因型比GG具有更长的PFS（CC/CG vs. GG： aHR=0.62，95%CI：0.39~0.99；CC vs. CG/GG： aHR=0.56，95%CI：0.32~0.97 ）。我们的研究发 现了rs1805794 C>G与早期NSCLC患者的预后相 关。早期病例携带CG+GG基因型比CC基因型的 死亡风险高（aHR=2.768，95%CI：1.273~6.017， P=0.010），可能与rs1805794 G等位基因比野生 型C等位基因更能降低MRN（MRE11/RAD50/ NBS1）复合物的水平有关，从而降低DNA的修复 能力影响预后。

BRCA1是一种抑癌基因，其表达的蛋白具 有重要的生物学功能，可影响DNA损伤修复、细 胞周期调节、基因转录调节等。BRCA1与MRN （MRE1/RAD50/NBS1）复合物相互作用，共同 参与DNA双链断裂修复。本研究结果显示，鳞癌 患者携带BRCA1 rs16942 AG+GG等位基因型较携 带AA基因型的预后更差（aHR=1.622，95%CI： 1.139~2.310，P=0.007），提示鳞癌患者较易出 现A>G的突变，从而提高BRCA1mRNA的表达， 增加死亡风险。许多研究表明BRCA1 mRNA的过 表达与NSCLC预后的关联：Rosell等^[17]对126例手 术切除患者的研究发现，BRCA1 mRNA过表达可 导致较差的预后。该研究还显示BRCA1 mRNA 的表达在鳞癌患者中显著高于腺癌患者，这与我 们的研究结果一致。目前对于吸烟与肺癌预后的 关联仍然存在争议。一些研究认为吸烟可导致更 差的生存^[18,19]，也有研究发现吸烟与肺癌预后无 存在关联^[20]。本研究虽未发现吸烟与否及吸烟量 与NSCLC预后存在关联，但联合DSBR基因分析 发现，临床早期的吸烟男性携带NBS1 rs1805794 突变基因CG+GG预后较差。而非吸烟女性腺癌 中携有NBS1 rs2735383突变基因GC+CC生存结 局较好。研究显示NBS1 rs1805794基因多态性与 吸烟存在交互作用^[7]，Kawai等^[21]发现吸烟缩短 男性肺癌患者生存。研究报道XRCC3 rs861537、 NBS1rs2735383多态性与肿瘤发病危险性有关，包 括肺癌、乳腺癌、膀胱癌、直肠癌等^[22]，然而， 较少研究他们与肺癌预后的关系。本研究发现 XRCC3 rs861537、NBS1 rs2735383、rs1805794与 晚期、早期吸烟男性NSCLC患者、非吸烟女性肺 腺癌患者的预后相关，但因分层后样本量较少， 此结果还须在更大样本量人群中进行验证。

国内外有关DNA修复基因多态性相关的生物 标志物与肺癌预后的研究结果尚不一致，需考虑 可能的影响：（1）肿瘤患者的预后涉及多阶段、 多基因通路，单独的任何一种基因多态性不可能 对生存结局产生巨大的效应，因此，基于通路的 联合分析和研究、评估通路中相互影响的多态性 的联合效应很重要。（2）肿瘤细胞可发生多种体 细胞突变，如SNPs、微卫星、插入和(或)缺失突 变、拷贝数变异（CNVs），非整倍体和杂合子丢 失、这些都可导致肿瘤的增长和侵袭等，DNA修 复通路的单系变异在NSCLC的肿瘤表型和临床结 局上不大可能产生广泛的效应^[23]。 （3）需较大 的人群样本量，尤其在进行分层分析时。本研究 发现XRCC3、BRCA1、NBS1基因多态性位点与NSCLC预后相关，有可能作为NSCLC患者预后的 参考生物标志物，但其结论仍需更大的队列研究 和功能验证。