食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是常见的难治性肿瘤之一，即 使是肿瘤早期的患者术后也极易发生淋巴结的转 移^{[1, 2]}。研究表明缺失某些肿瘤转移抑制基因而发 生转移的患者生存率更差^[3]。表明对可能发生淋巴 结转移的患者术后尽早进行放化疗可以提高患者 的生存质量，因此，寻找可以预测肿瘤是否发生 淋巴结转移的指标意义重大。

目前研究发现，KiSS-1在多种人实体肿瘤表达， 其表达的缺失与多种恶性肿瘤的转移呈正相关，同 时KiSS-1表达缺失的患者五年生存率更低^{[4, 5, 6]}。本研 究通过实时定量PCR方法检测KiSS-1在ESCC组 织和周围正常食管组织中的表达情况，分析其与 临床病理因素之间的关系，并探讨其在食管癌发 生、发展及转移中的作用。 1 资料和方法 1.1 临床资料

选取湖北省肿瘤医院2005年4月—2007年3月 确诊并手术治疗的ESCC患者标本65例，所有患者术前均未接受放疗和化疗。患者的临床资料和相 关病理信息来自于患者的病历和本院病理报告。 患者均被告知其组织标本用于本实验研究。其 中，男44例，女21例，年龄45~74岁，平均年龄 50.9岁。所有组织标本均进行TNM分期：Ⅰ期12 例，Ⅱ期21例，Ⅲ期24例，Ⅳ期8例。同时取距肿 瘤中心边缘至少5 cm处的正常食管组织作为对照 研究。所有患者均获随访，随访从手术日至2013 年2月，时间1~73月，平均36.8月。 1.2 方法

所有组织样本均在液氮中研碎,总RNA采用 Trizol (美国Life公司)提取，具体按说明书进行 操作。RNA样品A₂₆₀/A₂₈₀吸光度值在2.0左右为合 格。采用Thermo公司反转录试剂盒进行反转录 反应，反应条件如下：42℃孵育60 min，70℃孵 育5 min，终止反转录反应。利用2×PCR Taqman Universal PCR试剂盒(日本TaKaRa公司) 进行 PCR扩增,反应条件为50℃ 2 min，95℃ 10 min 预变性，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共40个循环。 以GAPDH作为内参基因。引物序列为：KiSS-1(F)5′-GACCTGCCTCTTCTCACCAA-3′，(R)5′-CAGTAGCAGCTGGCTTCCTC3′；GAPDH(F)5′-G G G T G T G A A CCAT G A G A A G T- 3 ′，( R) 5 ′ -GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。

所有反应均设立3个复孔，目的基因KiSS-1 计算方法为相对定量分析2^-△△Ct法。在ESCC组 织中，定义KiSS- 1表达量低于均数- 2倍标准误 （Mean-2×SE）为表达的缺失^[7]。 1.3 统计学方法

数据均采用SPSS18.0软件进行处理，组间差异 通过t检验和χ²检验，生存分析采用Kaplan-Meier分 析，病理因素对淋巴结转移的影响采用多因素的 Cox回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 KiSS-1在ESCC组织和正常食管组织中的表达

KiSS-1在65例ESCC组织和正常食管组织中均 有表达,且在ESCC组织中的表达（2.56±0.15）低 于在邻近正常食管组织中的表达（3.02±0.12）， 两者之间差异有统计学意义(P=0.017)，见图 1。

ESCC:esophageal squamous cell carcinoma 图 1 KiSS-1在65例食管癌组织和周围正常食管组织中的表达 Figure 1 KiSS-1 expression in 65 pairs of EC and adjacent normal esophageal tissues detected by qRT-PCR analysis

图选项

65例ESCC患者中有26例患者属于KiSS-1表达 缺失。KiSS-1表达缺失与ESCC患者临床病理因 素之间的关系，见表 1。经统计分析发现，KiSS-1 表达缺失与肿瘤的大小、分化程度、浸润程度以 及血管外膜受累之间无明显的相关性（P=0.480，P=0.827，P=0.823），而与淋巴结的转移有关 （P=0.011）。通过Cox回归分析发现KiSS-1是引 起淋巴结转移的一个重要因素。

表 1 KiSS-1在65例食管癌中的表达和一般临床病理因素之 间的关系 Table 1 Correlation between KiSS-1 expression and general clinicopathologic parameters in 65 ESCC patients

表选项

在随访过程中，有3例（其中KiSS-1表达缺失 1例）死于与本研究无关疾病，对余下62例患者 进行生存分析。根据Kaplan-Meier生存分析表明， KiSS-1表达缺失的食管癌患者相比表达阳性的患者 五年生存率更高（P=0.002），见图 2；多因素Cox 回归分析发现，KiSS-1表达缺失与否与淋巴结是否 发生转移有一定相关性（P=0.009），见表 2。

图 2 食管癌患者KiSS-1表达和生存时间之间的关系 Figure 2 Correlation between KiSS-1 expression and survival rates in 65 ESSC patients

图选项

表 2 临床病理因素对淋巴结转移影响的Cox回归分析 Table 2 Effect of clinicopathologic parameters on lymph node metastasis analyzed by multivariate analysis

表选项

Lee等^[8]通过转染KiSS-1至黑色素瘤和乳腺 癌细胞后发现转染KiSS- 1的细胞转移能力受到 抑制，证实KiSS- 1是一个新的肿瘤转移抑制基 因。最近有研究表明KiSS-1通过结合hOT7T175、 GPR54等引起一系列生理生化改变，从而增强成 簇黏附激酶的表达和活性，从而抑制肿瘤细胞的 迁移和侵袭能力^{[9, 10, 11]}。

KiSS-1在脑、胎盘等正常组织中均有不同程 度的水平表达^[12]。同时研究表明KiSS-1在多种人 实体肿瘤中表达缺失，并与肿瘤的转移密切相 关^{[9, 10, 13, 14]}。本实验结果显示在食管癌组织中， KiSS-1表达明显低于正常食管组织，二者统计学 有显著性差异；同时发现在有淋巴结转移的癌组 织中KiSS-1的表达明显降低，且KiSS-1表达缺失 明显高于不伴淋巴结转移的癌组织。表明KiSS-1 基因与食管鳞状细胞癌是否发生淋巴结转移有一 定的相关性。同时本研究结果还发现KiSS-1在不 同肿瘤大小、分化程度和浸润深度的癌组织中的 表达率无明显差异，说明KiSS-1的表达与食管鳞 癌的大小、组织学分级及浸润深度无关。

是否发生淋巴结转移影响食管癌患者的预 后，即使PET的广泛应用，早期判断是否发生淋巴 结转移也并易事。如果可以早期预测，我们就可 以对可能会发生淋巴结转移的食管癌患者早期就 开始进行放化疗。研究证实KiSS-1表达缺失会促进肿瘤发生转移^[15]。本实验中发现KiSS-1表达缺 失的患者发生淋巴结转移的可能明显增高，同时 KiSS-1表达缺失的患者五年生存率更差。

总之，在本研究中我们通过定量PCR发现 KiSS-1在食管癌组织中的表达明显低于邻近正常 食管组织，KiSS-1表达缺失与食管癌发生淋巴结 转移和患者的预后呈明显的相关性。KiSS-1可作 为食管癌患者五年生存率一个独立的预后因素。