钼是人体必需的微量元素,具有广泛的生物学 活性^[1] ,人体必须从外界摄取以满足机体的需要， 摄入不足或过量都会对健康产生影响。大量流行 病学调查和实验研究证实，环境中低钼与食管癌 发生有密切关系^{[2, 3]}，人体血清钼含量与胃癌发生 呈负相关^[4]，钼化合物对体外培养食管癌细胞有抑 瘤作用^[5]，而钼对肝癌细胞的作用报道甚少^[6]，对 结肠癌细胞的作用尚未见报道，本实验以体外培 养人肝癌和结肠癌细胞为研究对象，观察不同浓 度的钼酸氨对结肠癌和肝癌细胞的增殖抑制和细 胞周期的影响，旨在进一步探讨其抗肿瘤活性机 制，为微量元素钼用于肿瘤的防治提供初步的实 验依据。 1 材料与方法 1.1 主要药物、试剂及仪器

钼酸氨（天津化学试剂厂，纯度99.0%)以0.9% 氯化钠溶液溶解配成1 000 mg·L^-1的溶液，滤菌后置 4℃冰箱保存备用；RPMI 1640培养粉（美国Gibco 公司）、新生胎牛血清（杭州四季青有限公司）、 胰蛋白酶粉（美国Amresco公司）青链霉素混合液 （上海碧云天公司）、 AnnexinV-FITC/PI凋亡试 剂盒（南京凯基公司）、碘化丙啶(PI)和 RNA酶 试剂（美国Sigma公司）；超净工作台(BCM21000 型，苏州净化设备有限公司)、Co₂恒温培养箱 (SWJ2300TVBB，美国Quene公司)、倒置显微镜 (OLYMPUS2CK40，日本OLYMPUS公司) 、酶标仪 (STATFAX22100型，广州市倍威仪器有限公司) 、 流式细胞仪（美国BD公司，BDLSR Ⅱ）。 1.2 细胞株及其培养

人肝癌HepG2细胞株和结肠癌HCT-116细胞株 由武汉凯泰新生物技术有限公司馈赠，HepG2细 胞和HCT-116细胞用含100 u/ml青霉素、100 μg/ml 链霉素、10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，在 37℃、5%Co₂及饱和湿度下培养，换液传代至稳定 生长，调整适当浓度进行实验。 1.3 CCK-8法检测细胞增殖抑制

取对数生长期的HepG2和HCT-116细胞，用含 10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞密度为 4×10⁴ /L，每孔以100 μl细胞悬液接种于96孔塑料培 养板内，细胞贴壁后，吸去培养孔中的液体，实 验分三组：（1）药物组：加入含终浓度为0.101、 0.202、0.404 mmol·L^-1钼酸氨的培养液200 μl，（2） 对照组：在有细胞的培养孔内加入等量普通培养 液；（3）空白组：加入等量普通培养液无细胞，每 组设6个复孔。分别在24、48、72 h倒置显微镜下明 场视野拍照细胞形态学变化并加入CCK-8 10 μl，继 续培养3 h，于酶联仪上以波长490 nm测定各孔吸 光值(OD)，按下列公式计算细胞增殖抑制率，细 胞生长抑制率=(对照孔平均OD值－实验孔平均OD 值)/(对照孔平均OD值－空白孔平均OD值)×100%， 实验重复3次，绘制细胞增殖抑制曲线。 1.4 流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期的HepG2和HCT-116细胞,以每 孔4.0×10⁵个细胞接种于6 孔培养板中，每孔2 ml 培养液，培养24 h 贴壁后吸去培养孔中的液体， 药物组加入钼酸氨浓度分别为0.101、0.202、0.404 mmol·L^-1的培养液4 ml，对照组加等量不含钼酸 氨的培养液,每组设3个复孔，继续培养 24、48、 72 h，不同时间段收集细胞，PBS 洗1次，70%预 冷乙醇固定3~4 h，1 000 r/min 离心5 min收集细 胞，PBS再次洗涤离心后各管加入400 µl PBS重悬 细胞并加入50 µg/ml RNA酶和300 µg/ml碘化丙啶 （propidium iodide，PI）的混合液200 µl，避光染 色30 min，流式细胞仪检测细胞周期分布，实验重 复3次。 1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析,所 有计数资料以x±s表示,均数间差异采用方差分析, P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 HepG2和HCT-116细胞的形态学改变

倒置显微镜下观察，随着培养时间的延长， 对照组细胞饱满呈梭形，贴壁生长良好，细胞 轮廓清晰，细胞增殖旺盛，数量明显增加，而在 实验组中，0.101 mmol·L^-1组细胞变化不明显， 0.202 mmol·L^-1组和0.404 mmol·L^-1组细胞生长状态 明显较对照组差，细胞皱缩，贴壁不佳，有少量细 胞脱落漂浮在培养液中，细胞数目与对照组相比明 显减少，见图 1。

A:control group of HepG2 cells;B:HepG2 cells treated with 0.202 mmol·L-1 ammonium molybdate;C:HepG2 cells treated with 0.404 mmol·L-1 ammonium; D: control group of HCT-116 cells;E:HCT-116 cells treated with 0.202 mmol·L-1 ammonium;F:HCT-116 cells treated with 0.404 mmol·L-1 ammonium 图 1 不同浓度钼酸氨作用72小时HepG2细胞和HCT-116细胞形态的变化(×20) Figure 1 Morphological changes of HepG2 and HCT-116 cells cultured with different concentrations of ammonium molybdate for 72 h(×20)

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CCK-8结果表明不同浓度钼酸氨作用24 h后， HepG2和HCT-116细胞的增殖均受到抑制，随着药 物浓度增高和作用时间延长,其抑制作用越明显， 呈剂量时间依赖关系，且低浓度（0.101 mmol·L^-1） HepG2细胞受抑制显著于HCT-116细胞，高浓度 （0.202、0.404 mmol·L^-1）则相反，差异有统计学 意义(P<0.05)，见图 2和表 1。

图 2 不同浓度钼酸铵对肝癌结肠癌抑制作用比较 Figure 2 Inhibitory effect of different concentrations of ammonium molybdate on hepatoma and colon cancer

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表 1 各浓度钼酸铵作用不同时间后HepG2细胞和HCT-116细胞增殖抑制率(%,x±s) Table 1 Proliferation inhibition rates of HepG2 and HCT-116 cells treated with different concentrations of ammonium molybdate for different time(%,x±s)

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流式细胞仪检测结果分析,钼酸氨作用24 h 后，HepG2和HCT-116细胞的细胞周期各时相均发 生明显改变,HepG2细胞表现为G0/G1期细胞百分数 增加，S期、G2/M期细胞百分数减少，明显抑制细胞进入S期；HCT-116细胞除了相同的G0/G1期、 S期改变外，G2/M期细胞百分数增加，说明钼酸氨 尚能阻止HCT-116细胞由G2/M期向G1/G0期移行， 两者随着药物浓度增高和作用时间延长，细胞凋 亡峰越高，呈剂量时间依赖关系，且低浓度（0.101 mmol·L^-1）HepG2细胞改变显著于HCT-116细胞，高 浓度（0.404 mmol·L^-1）则相反，差异有统计学意义 (P<0.05)，不同浓度的钼酸铵作用72 hHepG2细胞和 HCT-116细胞的周期变化，见图 3和表 2。

A:HepG2 cells treated with 0.101mmol·L-1 ammonium;B:HepG2 cells treated with 0.202mmol·L-1 ammonium;C: HepG2 cells treated with 0.404mmol·L-1 ammonium;D:HCT-116 cells treated with 0.101mmol·L-1 ammonium;E:HCT-116 cells treated with 0.202mmol·L-1 ammonium;F: HCT-116 cells treated with 0.404mmol·L-1 ammonium 图 3 钼酸铵作用72h HepG2细胞和HCT-116细胞的周期变化图 Figure 3 Cell-cycles changes of HepG2 and HCT-116 cells treated with ammonium molybdate for 72h

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表 2 钼酸铵对HepG2细胞和HCT-116细胞细胞周期的影响(%,x±s) Table 2 Effect of ammonium molybdate on cell-cycles of HepG2 and HCT-116(%,x±s)

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钼的抗癌生化机制可能有：(1)钼是钼氧转移 酶，如黄嘌呤氧化酶、亚硫酸盐氧化酶和醛氧化 酶等的重要组分，这些酶与碳水化合物、脂肪、 蛋白质、含硫氨基酸、核酸(DNA和RNA)及铁蛋 白中铁的代谢密切相关。(2)钼是硝酸还原酶的组 分，此酶防止硝酸盐及亚硝酸盐与二级胺生成亚硝酸胺化合物，抑制亚硝基的致癌作用。(3)钼具 有与致癌剂N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)相互竞争 的能力，通过改变细胞代谢、细胞膜、染色体结 构来减轻致癌剂对DNA的损伤。(4)钼对肝P450酶和 去甲基化酶的活性有影响，小剂量钼可加速致癌 物亚硝胺的代谢，而大剂量的钼则相对减慢亚硝 胺的代谢^[7]。

钼对肿瘤的发生、发展具有预防和抑制作用 已得到共识^{[8, 9, 10]} ，但对其抑瘤的细胞生物学机制 研究甚少，本研究结果显示随着药物浓度由0.101 mmol·L^-1增加到0.404 mmol·L^-1，作用时间由24 h延 长至72 h，钼酸铵对肝癌细胞和结肠癌细胞生长状态的影响愈明显，增殖抑制率随之增高，0.404 mmol·L^-1浓度作用72 h最为显著，肝癌和结肠癌细 胞的增殖抑制率分别为78.72%和91.18%，提示钼 酸铵对体外培养人肝癌和结肠癌细胞均具有明显 的生长抑制作用，并呈一定的剂量和时间依赖关 系，与张学军等^[11]结果相似。

细胞周期调控机制的破坏导致肿瘤细胞失控 性生长，要抑制肿瘤细胞的生长，一方面可以通 过促进肿瘤细胞的凋亡，另一方面可以通过影响 细胞周期，使其不能进行正常的有丝分裂^[12]。本 实验不同浓度（0.101 mmol·L^-1 ~0.404 mmol·L^-1） 的钼酸铵均可影响HepG2和HCT-116细胞的细胞周期，改变各期的百分比并出现亚G1峰，即凋亡峰， 且随着药物浓度的增加和时间的延长（24~72 h） 细胞周期各期百分比及凋亡峰改变的幅度加大。 HepG2细胞表现为G0/G1期细胞百分数增加,S期、 G2/M期细胞百分数减少，据此推论钼酸铵可能通 过某种机制使细胞周期的G1/S检验点发生了阻滞, 使细胞不能从G1期进入到S期，将细胞特异性地 阻滞在G0/G1期，并出现凋亡峰。HCT-116细胞除 了G0/G1期和S期相同的改变外，G2/M期细胞百分 数增加，阻止HCT-116细胞由G2/M期向G1/G0期移 行。说明钼酸铵可以诱导肿瘤细胞出现G1期→S期 和G2→G1期阻滞和细胞凋亡，使许多肿瘤细胞不 能进行DNA合成或合成后不能进行有丝分裂，使 整个增殖周期延缓或中断,使细胞克隆形成减少， 从而抑制肿瘤细胞的增殖。

本实验结果尚显示低浓度钼酸铵（0 . 1 0 1 mmol·L^-1）对HepG2细胞增殖抑制和诱导凋亡作用 较HCT-116细胞显著增强，高浓度（0.404 mmol·L^-1） 则相反。细胞凋亡相关的基因或因子主要有： Bcl-2基因家族、Survivin基因、Caspase3基因、 P53抑癌基因、c-myc基因以及TGF-b、Fas/Fas-L 等，它们在肿瘤细胞中表达的高低与肿瘤的发 生、发展及凋亡有着密切的关系^[13]。而钼酸铵的 上述不同作用是否与这些基因或因子的表达有关 需进一步研究。

综上所述，钼酸铵对HepG2细胞和HCT-116 细胞均有增殖抑制、诱导凋亡和改变细胞周期作 用，本实验从细胞生物学水平初步探索了钼的抑 瘤机制，其对HCT-116和HepG2细胞的差异机制及 对肿瘤细胞在分子生物学水平的影响机制，还有 待于进一步的研究。