食管癌全球年新发病约为48万余例，年死亡 40多万例，中国食管癌粗发病率和粗死亡率均居 世界第1位，发病世标率第6位，死亡世标率位于 第12位^[1]。Maniotis等^[2]首次在高侵袭性葡萄膜黑色素瘤中发现血管生成拟态（vasculogenic mimicry， VM），后相继在肝癌、乳腺癌 ^[3]、结直肠癌 ^[4]、肾 透明细胞癌^[5]、食管癌 ^[6]等肿瘤中均发现存在VM 现象，并证实VM形成与肿瘤转移、侵袭、不良预 后明显正相关。已有研究表明缺氧能促进食管癌 VM形成，但其确切机制尚不清楚，Bcl-2介导的 VE-cad过表达可能促进黑色素瘤VM形成。本实 验拟通过在常氧和缺氧微环境下常规培养食管癌 细胞，三维培养观察管道结构形成情况，同时采 用Bcl-2干扰技术，探究其与VM形成相关因子VEcad和MMP-2的联系，探讨食管癌VM形成的可能 机制。 1 材料和方法 1.1 材料

人食管鳞癌细胞株Ec9706为郑州大学肿瘤 中心保存。二氯化钴购自Sig ma公司，胎牛血 清和DMEM培养液购自Gib co公司；基质胶购 自Becton Dickinson公司；Bcl-2-siRNA由上海 英俊生物技术有限公司构建；LipofectamineTM 2000(Invitrogen)、Trizol、反转录酶试剂盒、PCR 试剂盒（全式金）、DNA Marker购自全式金；鼠 抗人血管内皮钙黏蛋白(VE-cad)抗体、鼠抗人抗 凋亡蛋白（Bcl-2）抗体、鼠抗人基质金属蛋白酶 2（MMP2）抗体、鼠抗人β-actin抗体、兔抗鼠二 抗购自Sigma公司；彩色预染标准分子量蛋白购自 Genview。凋亡试剂盒购自南京凯基；标准蛋白浓 度测定试剂盒购自碧云天。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养

Ec9706细胞用含10%胎牛血清 的1640培养液，于37℃、5%Co₂培养箱中培养。 平均2~3 d传代1次，以保持细胞呈对数生长。 1.2.2 缺氧处理

化学缺氧剂CoCl₂用于模拟肿瘤 内缺氧微环境，加入培养液的终浓度是75 μmol/L。 1.2.3 实验分组

本实验分四组，常规环境培养下 的细胞设为常氧对照组，缺氧环境中直接培养的 细胞设为缺氧对照组，缺氧环境中进行载体干扰 的细胞设为缺氧实验组，缺氧环境中进行空载体 干扰的细胞设为缺氧空载体组。 1.2.4 Bcl- 2 - s iRNA转染细胞

取对数生长期 Ec9706细胞4×10⁵个，接种于培养皿中，培养于不 含抗生素的DMEM培养液中，细胞生长至约80% 聚合时开始转染，具体步骤参照Lipofectamine2000 说明书。转染后24 h按1:12的比例传代，48 h后用 含3 μg/ml Blasticidin (筛选浓度在转染前通过杀 伤曲线确定) 的选择性培养液进行筛选，约4周 后挑取克隆在选择性培养液中继续传代，扩大培 养。阴性对照质粒也按相同的办法进行转染。 PCR和Western blot法鉴定并检测单克隆细胞株的 转染效率。 1.2.5 三维培养观察管道结构形成情况

将冻存 的Matrigel原液置于4℃过夜使之溶解，24孔培养 板每孔加入300 μl Matrigel原液，轻轻摇动使之分 布均匀，37℃培养箱内孵育30 min待其凝固。每孔 接种单细胞悬液1ml，浓度为5×10⁵/ml，分别置于 常氧和缺氧条件下继续培养。24 h后终止培养，观 察各组细胞的管状结构排列情况及完整程度。随 机于倒置显微镜下取上、下、左、右、中心5个视 野摄像记录并计数管状结构数量，取每个视野的 均值。实验重复三次。 1.2.6 细胞凋亡检测

干扰前后的细胞以5×10⁵/孔 浓度接种于6孔板内，待细胞长至单层铺满后，用 不含EDTA的胰酶消化后收集细胞，加入染色液 Annexin V-EGFP及Propidium Iodide，作用15 min 后，于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。 1.2.7 RT-PCR检测血管生成拟态相关基因Bcl-2、 VE- cad及MMP2的mRNA表达情况

将处理后 的各组细胞用TRI zol一步法提取总RNA。引物 由上海生工生物有限公司设计并合成，β- actin 上游引物为CTGGGACGACATGGAGAAAA下 游引物为AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC， 扩 增片 段 为5 6 4 b p；B c l - 2上 游 引物T G G G A G A A C A G G G T A C G AT A A C，下 游 引 物 是G A A C T C A A A G A A G G C C A C A AT C， 扩 增 片 段 为4 4 8 b p；V E - c a d上 游 引 物 为 A G G A C ATA A C A C C A C G A A A C G，下 游 引 物 为C G G T C A A A C T G C C C ATA C T T， 扩 增 片 段 为1 2 1 b p；M M P 2的 上 游 引 物 为 TACTGGATCTACTCAGCCAGCA，下游引物 为CTTCAGGTAATAGGCACCCTTG，扩增片段 为300 bp。按照反转录试剂盒进行反转录合成 cDNA，并按扩增试剂盒说明书进行扩增，扩增产 物在1%琼脂糖凝胶电泳中以100 V稳压电泳1 h， 进行凝胶成像摄片并分析结果。 1.2.8 Western blot检测血管生成拟态相关基因VEcad、Bcl-2蛋白表达

细胞长至铺满培养瓶时，裂 解细胞并收集上清液于EP管中。采用BCA法测蛋 白浓度。余蛋白加热变性后于−20℃保存备用。制 胶上样，100 V稳压电泳2 h。100 V恒压1 h进行冰 浴电转至PVDF膜上，封闭液封闭1 h后TBST 10 min ×3次。加入一抗（bcl-2 1:1 000，VE-cad 1:1 000， MMP 21:1 000，β-actin 1:2 000），4℃封闭孵育过夜。次日TBST漂洗10 min×3次后，加入HRP标记 的二抗（1:2 000）孵育2 h后TBST漂洗。ECL化学 发光法显色，曝光，分析结果。 1.3 统计学方法

应用统计软件SPSS13.0进行数据处理，所得 数据以x±s表示。Tanon Gis软件对感光胶片条带进 行灰度值扫描，目的条带与内参条带的比值代表 目的基因蛋白的表达水平。多组样本均数的比较 采用单因素方差分析，两组样本均数的比较采用t 检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 三维培养体系观察各实验组结果

缺氧对照组(21.2±2.2)比常氧对照组(3.9±1.1) 形成更多的网络样管状结构(P＜0.000)；而在缺氧 下进行Bcl-2-siRNA干扰的实验组(2.5±1.2)网络样 管腔结构比缺氧对照组(21.2±2.2)和空载体组(19.9 ±2.1)显著减少(P＜0.000)；而缺氧对照组和空载体 组之间差异无统计学意义(P=0.051)，见图 1。

A:normoxia control group;B:hypoxia control group;C:hypoxia empty vector group;D:hypoxia experimental group 图 1 三维培养观察各组细胞管腔样结构形成能力（荧光倒置显微镜 ×200） Figure 1 Luminal-like structures forming ability of cells in each group in three-dimensional culture (Inverted fluorescence microscope ×200)

图选项

常氧对照组、缺氧对照组、缺氧空载体组和 缺氧实验组细胞的凋亡率分别为(6.17±0.17)、(0.6 ±0.12)、(1.2±0.12)和(22.63±0.37)，缺氧对照组 细胞凋亡率明显低于常氧对照组（P＜0.05）， 缺氧实验组细胞凋亡率显著强于缺氧对照组（P ＜0.05），见图 2。

A:normoxia control group; B:hypoxia control group; C:hypoxia empty vector group; D:hypoxia experimental group 图 2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率 Figure 2 Apoptosis rate in each group detected by flow cytometry

图选项

缺氧对照组Bcl-2，VE-cad的mRNA表达情 况均明显高于常氧对照组（P＜0.05），缺氧实 验组Bcl-2，VE-cad，MMP2的表达明显降低（P ＜0.05）。缺氧对照组和缺氧空载体组之间差异无 统计学意义（P＞0.05），见图 3。

1:normoxia control group;2:hypoxia control group;3:hypoxia empty vector group; 4:hypoxia experimental group 图 3 RT- PCR检测不同实验组细胞Bcl- 2、VE- ca d和 MMP2的mRNA表达情况(A)和表达灰度值(B) Figure 3 mRNA expression of Bcl- 2,VE- cad and MMP2(A)and gray value of Bcl-2,VE-cad,MMP2 mRNA expression(B)in different experimental groups detected by RT-PCR

图选项

缺氧对照组Bcl-2、VE-cad的蛋白表达情况均 明显高于常氧对照组（P＜0.05），缺氧实验组 Bcl-2、VE-cad、MMP2的表达较缺氧对照组明显 降低（P＜0.05），缺氧对照组和缺氧空载体组之 间差异无统计学意义（P＞0.05），见图 4。

1:normoxia control group;2:hypoxia control group;3:hypoxia empty vector group;4:hypoxia experimental group 图 4 Western blot法检测各组细胞Bcl-2、VE-cad、MMP2 的蛋白表达情况(A)及各蛋白表达灰度值(B) Figure 4 Prot ein expression of Bcl- 2,VE- cad and MMP2(A) and grayscale scanning(B) detected by Western blot

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食管癌的预后差与血液供应有极大的关系， 以往的治疗主要集中在内皮性血管生成上。然而 其血液供应不仅仅依赖于内皮性血管生成，血管 生成拟态发挥着同样重要的作用。血管生成拟态 的分子机制极其复杂，已有学者证明缺氧能诱导 胶质瘤、恶性黑色素瘤及肝癌细胞的血管生成拟 态，引起血管生成拟态相关分子的高表达^[7]。缺氧 亦能诱导食管癌细胞血管生成拟态的形成，并诱 导肿瘤组织对放疗、化疗的耐受性，导致肿瘤生 长、侵袭和转移。Zhao等研究了乳腺癌中，在缺氧 微环境下，Bcl-2高表达促进了VE-cad的高表达， 并由此介导了更多管状结构的形成，以及VM相关 蛋白的高表达 ^[8]。

VE-cad是广泛表达于内皮细胞的黏合蛋白， 能促进细胞-细胞间的相互作用^[9]，是内皮细胞黏 附的主要组分，施瑞华等证实VE-cad下调可以抑 制血管生成拟态的形成，并抑制细胞增殖促进细 胞凋亡^[10]。Bcl-2是抗凋亡蛋白家族的重要成员之 一，可以和Bax相互作用控制细胞死亡，也可以作 为载体促进转录因子迁移至细胞核内，引起相关 分子的表达甚至高表达^[11]。但在我们的研究中， 推测Bcl-2可充当促转录因子来调节VM相关分子 VE-cad表达的上调^[12]，并由此介导食管癌细胞血 管生成拟态的形成。在本研究中，我们采用RNA 干扰技术沉默Bcl-2的表达，并检测干扰前后细胞 的表达情况。数据表明，缺氧后Bcl-2表达的上调 引起VE-cad表达的上调，同时形成更多的网络样 管状结构，并诱导细胞增殖，降低凋亡率。同时 数据也表明，在缺氧环境中，Bcl-2-siRNA下调 Bcl-2的表达后，VE-cad的表达几乎消失，VM结 构及形态也几近消失，凋亡也明显增多，VM的相 关蛋白的表达也显著降低。

我们研究证实在缺氧微环境中，Bcl-2可能激 活VE-cad的转录调节启动子，介导VE-cad的过表 达，并促进更多VM结构的形成。这可能是缺氧诱 导VM形成的分子机制^[13]。这一研究发现为VM形 成的分子机制提供新的视角，可用于寻找新的抗 肿瘤血管生成的药物。