甲状腺癌为常见恶性肿瘤，近20年来其发生 率明显增加^[1]。多数甲状腺癌系分化型，治疗效果 及预后较好，虽然甲状腺癌中的髓样癌或未分化 癌所占比例较小，但属难治性甲状腺癌，临床治 疗效果和预后极差，其中位生存时间仅约5月，1年生存率不足20% ^[2]，因此人们对此类难治性甲状 腺癌期待能有更有效的治疗手段。分子靶向治疗是 一种颇具应用前景的新型肿瘤治疗手段^[3]。血管生 成（angiogenesis）为肿瘤生长、侵袭和转移的重要 基础，抑制肿瘤的血管生成则成为抗肿瘤治疗的另 一重要途径^{[4, 5]}。一些分子靶向药物可作用于癌细胞 及血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VEC）， 血管内皮生长因子及其受体（vascular endothelial growth factor receptors,VEGFR）则成为控制肿 瘤生长和肿瘤血管生成的重要生物作用靶点^[6]。 VEGFR在许多肿瘤包括甲状腺癌呈过度表达^[7]， 可促使肿瘤的生长及其血管生成。因此，通过对 肿瘤细胞和VEGFR的靶向抑制作用可以抑制肿瘤 的生长及其血管生成^{[4, 5, 6]}。

近几年来，各种酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kanise inhibitors,TKI）被广泛用于抗肿瘤治疗^{[8, 9]}及 各种甲状腺癌的治疗^{[10, 11]}。替沃扎尼（tivozanib） 为一种新型小分子TKI，可高选择性地靶向作用于 VEGFR ^[12]，已被用于治疗一些肿瘤的Ⅱ、Ⅲ期临床 实验，并收到一定的治疗效果^[13]，但尚未见有关其 对甲状腺癌作用影响的文献报告。本研究观察了 替沃扎尼对甲状腺未分化癌细胞株SW579和VEC 生长增殖的影响及其作用机制，结果显示替沃扎 尼通过细胞周期休止作用抑制细胞的增殖，提示 替沃扎尼作为一种新型的分子靶向药物有可能通 过抑制甲状腺癌细胞和VEC的生长增殖及肿瘤的 血管生成而发挥其抗肿瘤作用。 1 材料与方法 1.1 主要材料

L - 1 5培 养 液 （ 北 京 钮 因 华 信 公 司 ） ， RPMI1640培养液和胎牛血清（美国Hyclone公 司），人未分化型甲状腺癌细胞珠SW579（中国 科学院上海生命科学研究院），人脐静脉内皮细 胞珠HUVEC（中国医学科学院肿瘤研究所）。替 沃扎尼（美国Selleck Chemicals公司），细胞活度 测定试剂盒（CCK-8）（日本Dojindo公司），结 合FITC的抗α微管蛋白鼠单克隆抗体（美国Sigma 公司），细胞周期试剂盒（美国BD公司）， FACSCalibur流式细胞仪（美国BD 公司）。 1.2 细胞培养

SW579和HUVEC分别以L-15培养液（100%空 气、37℃）和RPMI1640培养液（5%CO₂、37℃） 培养，培养液含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和 100 μg/ml链霉素。细胞经传代培养、液氮冻存备 用。每次实验前将细胞复苏、培养，以一定的细 胞密度接种于96孔板或细胞培养皿用于实验。所 有实验均采用同一代细胞。 1.3 CCK-8法测定细胞活度

将SW579和HUVEC分别培养于96孔板24 h 后，暴露不同浓度的替沃扎尼（1、2、4、8和16 μM），未接受替沃扎尼处理（0 μM）的细胞作 为对照。每种处理置3个复孔。在细胞培养的0、 24、48和72 h，按CCK-8试剂盒说明，通过分光光 度仪测定450 nm吸光度。绘制细胞增殖曲线，估 计细胞半数抑制浓度（IC₅₀）。 1.4 图像系统观察分析细胞增殖情况^[14]

将SW579和HUVEC培养24 h后，暴露于各自 IC₅₀的替沃扎尼（分别为4 μM和8 μM），在细胞 培养的0、24、48和72 h，通过图像分析系统采用 连续视野照相，留取同一视野不同时点的系列细 胞图像。分别计数每个视野的细胞数并得到细胞 密度(细胞数/cm²)，计算各组细胞每个时点的平均 细胞密度，绘制细胞密度曲线。 1.5 免疫荧光染色及细胞分裂指数测定评价细胞 增殖能力^[14]

将SW579和HUVEC培养24 h后，暴露于各自 IC₅₀的替沃扎尼，在细胞培养的24和48 h，细胞以 4%甲醛溶液固定15 min，0.1%三硝基甲苯溶液透化 3 min，以结合有FITC的抗α-微管蛋白抗体（稀释度 1∶100）和1 μg/ml碘化丙啶孵育1 h，进行细胞微 管及细胞分裂纺锤体和DNA染色，荧光显微镜下 连续视野观察计数分裂期和间期细胞，计数细胞 > 1 000个，然后计算细胞分裂指数（mitosis index， MI），MI=(分裂期细胞数/总细胞数)×100%。 1.6 流式细胞仪分析细胞周期^[14]

将SW579和HUVEC培养24 h后，暴露于各自 IC₅₀的替沃扎尼，在细胞培养的24和48 h，按细胞 周期分析试剂盒说明，收集细胞（每管>1×10⁶个 细胞），细胞以75%乙醇固定1 h，PBS漂洗后用 含RNA酶（20 μg/ml）及碘化丙啶（20 μg/ml）的 测试缓冲液孵育30 min，通过流式细胞仪进行细胞 DNA 含量及细胞周期时相分析。 1.7 统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。各 项数据均来自2~3次独立的实验。计量资料以均数 ±标准差表示。两组间均数采用t检验，多组间均 数比较采用方差分析，组间比较采用χ²检验，以 P<0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 替沃扎尼抑制SW579和HUVEC的增殖 2.1.1 细胞活度测定结果

未接受替沃扎尼（0 μM） 处理的对照细胞，细胞活度（吸光度）随培养时间的增加而逐渐增加，而接受替沃扎尼处理的SW579或 HUVEC其吸光度的增加受到抑制，并呈时间和剂量 依赖性，两种细胞的IC₅₀估计值分别为4 μM和8 μM， 见图 1、2。

图 1 不同浓度替沃扎尼对甲状腺癌SW579细胞活度的影响 Figure 1 Effect of tivozanob at different concentrations on the activity of thyroid cancer cell line SW579

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图 2 不同浓度替沃扎尼对血管内皮细胞活度的影响 Figure 2 Effect of tivozanob at different concentrations on the activity of vascular endothelial cell line HUVEC

图选项

未接受替沃扎尼（0 μM）处理的对照细胞其密度随培养时间的增加而 逐渐加大，而暴露于替沃扎尼IC₅₀浓度的SW579或 HUVEC其细胞密度的增加明显减缓，细胞的生长增 殖受到明显抑制见图 3、4。

图 3 替沃扎尼抑制SW579和HUVEC的生长(×100） Figure 3 Tivozanib inhibited the growth of SW579 and HUVEC (×100)

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图 4 替沃扎尼抑制SW579和HUVEC的增殖 Figure 4 Tivozanib inhibited the proliferation of SW579 and HUVEC

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此外，SW579和HUVEC在相应IC₅₀的替沃扎 尼作用下（72 h），镜下未见有明显的凋亡细胞， 见图 3。但当两种细胞在大于其IC₅₀的替沃扎尼作 用下，镜下可见到少量的凋亡细胞。 2.1.3 细胞MI分析结果

与相应的对照细胞相比， SW579暴露于IC₅₀的替沃扎尼24 h时，其MI尚无明 显降低，但48 h时其MI有所下降；而HUVEC暴露 于IC₅₀的替沃扎尼24和48 h时，其MI均明显降低， 但差异无统计学意义，见表 1。

表 1 替沃扎尼对SW579和HUVES分裂指数(%)的影响 Table 1 Effect of tivozanib on MI(%) of SW579 and HUVES

表选项

流式细胞仪细胞周期分析显示，SW579和HUVEC 在各自IC₅₀的替沃扎尼作用下均发生明显的细胞周 期休止，但SW579休止于G₁期，表现为G₁期细胞 比例显著增加，而HUVEC则休止于G₂/M期，表现 为G₂/M期细胞比例显著增加。与暴露于替沃扎尼 24 h之细胞相比，替沃扎尼作用48 h后，两种细胞 的细胞周期休止效应进一步增强，见图 5。此外， SW579和HUVEC在IC₅₀的替沃扎尼作用下，其DNA 含量分析图上均未提示细胞凋亡的G₁前峰。

图 5 SW579和HUVEC分别被替沃扎尼休止于细胞周期的G1期和G2/M期 Figure 5 Tivozanib arrested cell cycles of SW579 and HUVEC at G1 and G2/M phases respectively

图选项

肿瘤分子靶向治疗因具有选择性强、不良反 应小等优点而成为一种颇具应用前景的新型肿瘤 治疗手段^[3]。分子靶向药物除可直接作用于肿瘤 细胞外，VEC也为其作用的靶细胞，肿瘤细胞 和VEGFR则为其抑制细胞生长的重要靶点^[6]。VEGFR为跨膜受体蛋白-酪氨酸激酶超家族中的 重要成员，VEGF与其结合并将之激活，活化后 的VEGFR则可转导一系列增殖信号从而促使细 胞的增殖^[15]。VEGFR在许多肿瘤包括甲状腺癌常 过度表达^[7]，从而促使肿瘤的生长及其血管生成， 因此一些分子靶向药物可通过作用于肿瘤细胞和 VEGFR以抑制肿瘤的生长及其血管生成而发挥其 抗肿瘤作用^{[4, 5, 6]}。近些年来，各种TKI已被广泛用于 抗肿瘤治疗^{[8, 9]}，包括各种甲状腺癌的治疗^{[10, 11]}。

临床前实验研究显示，作为一种TKI，替沃 扎尼可抑制多种肿瘤细胞和VEC的增殖及肿瘤 血管生成^[12]。国内也已完成了该药的实验室合成工作^[16]。本研究结果显示，替沃扎尼对SW579和 HUVEC的增殖均具有明显的抑制作用，其生长 抑制作用均呈时间和浓度依赖性，对SW579和 HUVEC的半数生长抑制浓度（IC₅₀）分别约为4 μM和8 μM。SW579和HUVEC在其IC₅₀作用下生长 增殖均受到明显的抑制，MI明显下降。

尽管替沃扎尼已被用于多种肿瘤治疗的Ⅱ、 Ⅲ期临床试验，但其抑制肿瘤生长及血管生成 的作用机制尚不十分清楚。有研究显示，一些 抗细胞增殖药物可通过诱发细胞周期休止或细 胞凋亡从而抑制肿瘤细胞的增殖，其作用受药 物浓度的影响^[17]。近来研究显示，TKI范得它尼 （vatalanib）和帕唑帕尼（pazopanib）可诱导慢 性淋巴细胞性白血病细胞发生凋亡，但其致凋亡 作用具有剂量依赖性和细胞特异性，低剂量时癌 细胞的凋亡发生率也较低，而在同样的低剂量 下，癌细胞可发生明显的凋亡，而健康的B淋巴 细胞则较少受到影响^[18]。本研究亦显示，当替沃 扎尼剂量高于SW579和HUVEC的IC₅₀时，两种细 胞均可发生一定的凋亡，而在IC₅₀的替沃扎尼作用 下，两种细胞则未发生明显的凋亡。流式细胞仪 细胞DNA含量分析图上也未见到提示细胞凋亡的 G₁前峰，但可诱使SW579和HUVEC发生明显的细 胞周期休止，提示替沃扎尼对两种细胞的生长抑 制作用源于其对细胞周期的休止而非诱发细胞凋 亡。细胞增殖受细胞周期的控制。许多控制细胞 增殖的信号作用于G₁期^[19] ,但亦可作用于S期、G₂ 期及M期^[20]。本研究显示，替沃扎尼对SW579和 HUVEC增殖的抑制均系通过对细胞周期的休止， 但对两种细胞的作用时相有所不同，SW579被休 止于G₁期，而HUVEC则被休止于G₂/M期。

本研究表明，替沃扎尼对甲状腺癌细胞和血 管内皮细胞的生长增殖均具有显著抑制效应，其 作用是籍对细胞周期的休止作用而实现，但两种 细胞发生细胞周期休止的时相不同，这提示，替 沃扎尼导致两种细胞发生细胞周期休止的内在分 子机制及信号转导通路可能有所不同，其详细机 制尚有待于进一步研究。替沃扎尼作为一种新 型的TKI分子靶向药物，通过高特异性地作用于 VEGFR，有可能通过抑制甲状腺癌细胞和VEC的 增殖及肿瘤的血管生成而发挥其抗肿瘤作用，具 有一定的应用前景。