奥沙利铂作为第三代铂类抗肿瘤药物，联合5- 氟尿嘧啶及亚叶酸钙（5-Fu/CF）组成的FOLFOX方案已成为进展期及转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer,CRC)的一线化疗方案^[1]。其特 征性不良反应为外周神经剂量限制性毒性，在 接受奥沙利铂治疗期间，疼痛症状发生率高达 85%~95%^[2,3,4]，以痛觉过敏、痛觉超敏或异常性疼 痛为主要特征，严重影响患者生活质量并限制了其 临床广泛应用。研究指出，奥沙利铂作用主要靶器 官为背根神经节(dorsal root ganglions，DRG) ^[5,6]， 但其具体机制目前尚不明确。

Navl.7是河豚毒素敏感性（tetrodotoxin- sensitivity，TTX-S）钠通道，主要表达在DRG伤 害性感受器的小神经元。调控编码Navl.7α亚基基 因为SCN9A，近年的研究指出SCN9A基因不同位 点突变导致了疼痛相关疾病的发生：红斑性肢痛症 （inherited erythromelalgia，IEM）^[7]、先天性无痛症 （congenital insensitivity to pain，CIP）^[8]以及阵发性剧 痛症（ paroxysmal extreme pain disorder，PEPD）^[9]。 本研究拟通过观察Na_v1.7在DRG表达变化，探讨 Na_v1.7在奥沙利铂诱发神经病理性疼痛发生发展中 的作用，为疼痛治疗寻找特异的分子靶点。 1 材料和方法 1.1 模型建立及分组

清洁级成年雄性SD大鼠96只（购自河南省实 验动物中心），体重约190~230 g。购回后在实验 室动物房适应性饲养1周，光照08:00~20:00，室 温维持在25℃左右，自由进食水。所有试验操作 均在08:00~20:00完成。按随机数字表法随机均分 为两组。OINP组：奥沙利铂（购自江苏恒瑞医 药股份有限公司）溶于5%葡萄糖（浙江济民制 药股份有限公司）注射液中，以奥沙利铂6 mg/kg 即1 ml/100 g体积比一次性腹腔注射给药；Vehicle 组：按1 ml/100 g体积比一次性腹腔注射给予5%葡 萄糖注射液。 1.2 疼痛评价

采用von Frey纤维丝以“up and down”法^[10,11]对大 鼠给药前及给药后1~10 d 50%缩足阈值进行测定。 1.3 标本获取

大鼠于造模后第3、7、10 d以10%水合氯醛 350 mg/kg腹腔注射麻醉，取其第L3~5 DRG，用于 后续实验。其中各组用于IHC、RT-PCR、Western blot大鼠分别为6只、4只、6只。 1.4 免疫组织化学法

获取新鲜标本于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中 固定，脱水，石蜡包埋，3 μm厚连续切片。脱蜡， 高压修复，滴加3%H2O2，37℃培养箱孵育20 min， 滴加山羊血清工作液，37℃培养箱孵育20 min，滴 加Na_v1.7一抗(美国abcam公司，1:100)，4℃过夜； PBS洗片，滴加二抗，37℃培养箱孵育30 min，滴加 辣根酶标记卵霉链白素，37℃培养箱孵育30 min， DAB显色，自来水中止；苏木精对比染色；常规洗 片、脱水、透明、封片。同时设置阴性对照片。 1.5 RT-PCR法

引物设计：内参β-actin基因引物（452 bp）: 上游5'-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'； 下游5'-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3'； Na_v1.7基因SCN9A引物（193 bp）：上游 5'- GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3' ；下游 5'-TCCCGTCAGGAAATGAGATG-3'。总RNA提 取：取新鲜DRG标本，以Trizol Reagent提取总 RNA；应用Tkara反转录试剂盒:基因组DNA去除 反应→反转录反应→PCR。反应参数：引物94℃预 变性5 min；94℃变性40 s，54℃（SCN9A）/6 0℃ (β-actin)退火30 s，72℃延伸40 s,进行35个循环， 72℃延伸5 min。取β-actin及SCN9APCR扩增产物 各5 μl行1%琼脂糖凝胶电泳，并采集图像。 1.6 Western blot法

总蛋白的提取→蛋白含量的测定→SDS-PAGE 电泳（8%分离胶，10%浓缩胶；浓缩胶时电压为 100 V，分离胶时电压为120 V，电泳总共大约需时 为100 min）转膜（恒压110 V，90 min）→免疫反应 （一抗稀释比Na_v1.7 1:500，β-actin 1:1 000；二抗稀 释比为1:3 000）→化学发光（曝光时间Na_v1.7 约1 h，β-actin 1~5min）→显影，定影→图像采集。 1.7 图像分析

所有采集图像以Biosens Digitl Imaging System v1.6图像分析软件进行阳性区平均积分光密度值 （IOD）采集。 1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。定量资料 以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单 因素方差分析（ANOVA），若不符合正态性或方 差齐性，则行非参数检验（Kruskal-Wallis test）， 若有统计学意义再行LSD-t检验。以P<0.05表示差 异有统计学意义。 2 结果 2.1 给药前后大鼠痛域变化

OINP组与Vehicle组给药前50%缩足阈值差异 无统计学意义。OINP组从注射奥沙利铂后第1天起 即出现明显的下降，并且持续到给药后第7天,分别 与给药前及相应天数Vehicle组相比差异有统计学 意义（P＜0.05）；从第8天开始，OINP组50%缩 足阈值较给药前及相应天数Vehicle组变化的差异 无统计学意义；而Vehicle组给予葡萄糖注射液前 后50%缩足阈值变化差异无统计学意义，见图 1。

*:P<0.05,compared with vehicle group 图 1 给药前后奥沙利铂诱发神经病理性疼痛和介质葡萄糖 注射组大鼠50%缩足阈值的变化情况 Figure 1 Changes of the 50% mice paw withdrawal threshold(PWT) before and after the administration in oxaliplatin-induced neuropathic pain(OINP) group and medium glucose injection(Vehicle) group

图选项

Na_v1.7在OINP组与Vehicle组DRG中均有表 达，表达于神经元细胞胞质，呈棕黄色颗粒状染 色。给药后3、7、10天 Vehicle组Na_v1.7表达差异 无统计学意义；与Vehicle组比，OINP组3、7、10 天Na_v1.7表达增强，差异有统计学意义(P<0.05)。 且OINP组3天 Na_v1.7表达最强，7天次之，10天最 弱，差异有统计学意义(P<0.05)，见图 2、3。

A:Vehicle group 3d; B:OINP group 3d;C: Vehicle group 7d; D:OINP group 7d;E: Vehicle group 10d;F:OINP group 10d 图 2 免疫组织化学法检测Nav1.7在大鼠背根神经节组织中的表达（SP法 ×400） Figure 2 Nav1.7 expression in the mice dorsal root ganglion cells detected by immunohistochemical staining(SP staining ×400)

图选项

a:P<0.01,compared with Vehicle group;b: P<0.01,compared with OINP group 10d;c:P<0.01,compared with OINP group 7d 图 3 免疫组织化学法检测Nav1.7在大鼠背根神经节组织中 的表达结果分析 Figure 3 Nav1.7 expression in the mice dorsal root ganglion cells detected by immunohistochemical staining

图选项

Na_v1.7 mRNA在OINP组与Vehicle组DRG均有 表达。Vehicle组与OINP组给药后3、7、10天， Na_v1.7mRNA相对表达量差异均无统计学意义；与 Vehicle 3、7、10天组Na_v1.7 mRNA相对表达量分 别相比，OINP组3、7、10天Na_v1.7 mRNA相对表 达量差异无统计学意义，见图 4。

M:marker;1,7:Vehicle group 3d; 2,8: Vehicle group 7d; 3,9: Vehicle group 10d;4,10: OINP group 3d; 5,11: OINP group 7d; 6,12: OINP group 10d 图 4 RT-PCR法检测Nav1.7mRNA在大鼠背根神经节组织 中的表达 Figure 4 Nav1.7 mRNA expression in the mice dorsal root ganglion cells detected by RT-PCR

图选项

Na_v1.7蛋白在OINP组与Vehicle组DRG中均有 表达，分子量为226 kD。给药后3、7、10天 的 Vehicle组Na_v1.7相对表达量差异无统计学意义；与 Vehicle组相比，OINP组3、7、10天 Na_v1.7相对表 达量增加，差异有统计学意义（P<0.05）,且于给 药3天Na_v1.7相对表达量最多，7天组次之，10天组 最少，差异有统计学意义（P<0.05），见图 5。

A:1: OINP group 3d;2:OINP group 7d;3:OINP group 10d;4:Vehicle group 3d;5:Vehicle group 7d;6:Vehicle group 10d; B:analysis of the relative expression of Nav1.7; a:P<0.01,compared with Vehicle group;b:P<0.01,compared with OINP group 10d;c:P<0.01 compared with OINP group 7d 图 5 Western blot法检测Nav1.7在大鼠背根神经节组织中的表达 Figure 5 Nav1.7 expression in the mice dorsal root ganglion cells detected by Western blot

图选项

目前已克隆出九种电压门控钠离子通道亚 型，Na_v1.1~Na_v1.9。其中Na_v1.3、Na_v1.7、Na_v1.8 及Na_v1.9四种亚型在伤害性感受及慢性疼痛的研 究比较多。尤其是Na_v1.7，2004年我国学者杨勇 等^[7]首次报道SCN9A基因突变造成Na_v1.7功能增 强导致红斑性肢痛症（IEM）的发生；2006年 Cox等^[8]报道SCN9A突变导致人类先天性无痛症 （CIP），但患者其他功能均正常；随后的研究^[9] 指出，Na_v1.7功能增强性突变亦可导致阵发性剧痛 症（PEPD）的发生。由此表明 Na_v1.7可能是治疗 疼痛的高效特异靶点。

Na_v1.7是TTX-S钠离子通道，主要分布在背根 神经节（DRG）及交感神经节神经元^[12,13,14]。最近 的研究指出，Na_v1.7亦是嗅觉感觉神经元中主要钠 离子通道亚型^[15,16]。在DRG内，Navl.7表达在A类 与C类纤维，主要定位于小直径的传导伤害性感觉 的神经元胞质，参与疼痛信号的传递^[14]。此外， 与其他TTX-S钠通道亚型一样，Navl.7具有快激活 及快失活特性^[17,18]。不同的是^[19,20]，Navl.7具有慢 速从快失活状态恢复的特性，这一特性使其区别 于其它TTX-S钠通道亚型，使Navl.7在神经元兴奋 性的产生中起了关键作用。此外，Navl.7具有缓慢 关闭状态失活的特性，此特性可产生弱的钠电流 导致弱而慢的去极化。这些特性使得Navl.7钠通道 放大发生器电位，并因此作为判定动作电位敏感 性的一个阈值通道^[21]。在伤害性感受神经元，增 加Na_v1.7钠通道活性或者密度，如功能增强性突变 和炎性痛，会降低动作电位阈值并放大伤害性刺 激，从而导致疼痛感觉的增强^[22]。

本研究参考Ling等^[23]的研究方法，一次性腹 腔注射给予SD大鼠奥沙利铂6 mg/kg，建立奥沙利 铂诱发神经病理性疼痛模型。对于给药量的考虑 为：在临床化疗中，奥沙利铂给药剂量通常为每 周期85 mg/kg，每两周为一个化疗周期；或者是 每周期给药130 mg/kg，每三周一个化疗周期。而 奥沙利铂最大可耐受剂量为200 mg/m2 ，恰好约折 合以体重为参考的给剂量6 mg/kg^[24]。von Frey纤 维丝测定结果显示：奥沙利铂诱发神经病理性疼 痛模型组（OINP组）从注射奥沙利铂之后第1天 起50%缩足阈值即出现明显的下降，第3天达最低 值，并且阈值下降持续到给药后第7天，与给药前 及Vehicle组相比差异有统计学意义（P<0.05）； 从第8天开始，50%缩足阈值较给药前及Vehicle组 变化差异无统计学意义；而Vehicle组50%缩足阈 值给药前与葡萄糖注射液组相比差异无统计学意 义。Ling等研究^[23]指出：给药奥沙利铂6 mg/kg大 鼠从第2d起开始出现缩足阈值明显下降且持续至 第8d，而我们的模型是持续下降到第7d，结果基 本一致，分析其不同之处可能是不同实验条件及 人为因素造成。

成功建立奥沙利铂诱发神经病理性疼痛动物 模型后，我们采用免疫组织化学及Western blot方 法对Na_v1.7在DRG的表达情况做出研究，且这两 种方法分析结果一致。结果显示：Na_v1.7在OINP 组与Vehicle组DRG中均有表达。与Vehicle组相 比，OINP组给药后3、7、10天组，Na_v1.7表达均 增加，差异有统计学意义（P<0.05）；且OINP组 3天模型Na_v1.7表达最强，7天组次之，10天组最 弱，差异有统计学意义（P<0.05）。我们分析， 在OINP模型大鼠，Na_v1.7表达上调，提示Na_v1.7可 能参与了奥沙利铂诱发神经病理性疼痛的发生与 维持。其中OINP模型3d组Na_v1.7表达水平最高， 与行为学测定结果在给药后第3天大鼠50%缩足阈 值达到最低值相一致；而Na_v1.7在第10天表达明显 减弱，这与行为学测定第10天大鼠疼痛行为基本 恢复至给药前水平相符，这些结果均间接支持了 Na_v1.7可能参与了奥沙利铂诱发神经病理性疼痛的 发生与维持。但本研究结果指出，OINP模型10天 组Na_v1.7水平高于对照组，但行为学检测未见明显 疼痛行为，考虑当Na_v1.7水平高于某一特定阈值方 可诱发疼痛行为。结合既往研究，我们推测：奥 沙利铂可能蓄积在背根神经节，造成周围神经的 损伤，导致伤害性感受发生，Na_v1.7表达上调，通 过降低动作电位阈值并放大伤害性刺激，最终导 致疼痛感觉甚至异常性疼痛的发生。

此外本研究还采用RT-PCR的方法对Na_v1.7 mRNA的表达予以研究，但结果显示：与蛋白表 达不同，在奥沙利铂诱发神经病理性疼痛模型 组，Na_v1.7 mRNA表达没有显著变化。据此我们 分析，Na_v1.7的表达在mRNA水平没有变化而在蛋 白水平发生了改变，提示神经病理性疼痛状态下 Na_v1.7的表达上调可能在转录后调控；另一方面, 也可能是我们一次性给予奥沙利铂，诱发出神经 病理性疼痛持续时间较短，mRNA水平尚未做出 调控。具体机制还需进一步深入研究。