细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase,ERK) 是有丝分裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases，MAPKs) 家族 的一个重要亚族，ERK的功能是控制细胞分化， ERK的活化被认为与细胞的分化、癌变和恶性进 展程度等密切相关^[1]。而ERK2是ERK的一个重要 成员。本研究通过检测人脑胶质瘤组织及正常脑 组织中ERK2蛋白的表达情况，探讨其在人脑胶质 瘤发生发展中的意义。

连续收集广东医学院神经外科2011年12月— 2012年5月间42例行手术治疗并经病理组织学检查 确诊的原发性人脑胶质瘤患者，每例标本均液氮速 冻，贮存温度：-80℃，另取相同部位组织标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，制备成石蜡标本。其中 男24例，女18例，年龄8~74岁，平均37.3±2.4岁。 病程最短为14天，最长为3.5年，平均为6月。组织 学分型及病理分级按WHO(2000年)神经系统肿瘤 分类标准，见表 1。对照组6例正常脑组织取自外伤 后内减压术的非肿瘤患者。所有标本均征得患者及 家属同意，并在标本收集知情书中签字。

表 1(Table 1)

表 1 42例人脑胶质瘤临床病理标本 Table 1 Clinicopathologic specimen of 42 cases of human glioma

表 1 42例人脑胶质瘤临床病理标本 Table 1 Clinicopathologic specimen of 42 cases of human glioma

人脑胶质瘤石 蜡包埋标本制成5 μm厚的切片，脱蜡、水化后， 3% H2O2灭活内源性酶，分别与一抗(兔抗ERK-2 多克隆抗体，1∶1 000稀释)、二抗(生物素标记 羊抗兔IgG，1∶400稀释)及辣根过氧化物酶标记 的链霉素亲和素复合物(1∶400稀释)孵育；DAB 显色，苏木精对比染色，封片观察。染色结果判 定:排除非特异性染色前提下，黄色，棕黄色，棕 褐色为阳性。在切片染色均匀的肿瘤区随机取5 个高倍视野（×200），共计500个细胞，按染色 强度（staining intensity,SI）和阳性细胞百分率 （percentage of positive cells,PP）的乘积计算免疫 反应评分（immunoreactive score,IRS），IRS=SI ×PP。SI计分：无着色0分，浅黄色1分，棕黄色 2分，棕褐色3分。PP计分：无阳性细胞0分，阳 性细胞率≤10%为1分，＞10%~50%为2分，＞ 50%~75%为3分，＞75%为4分。IRS表达强度判 断：0分为阴性（-），1~4分为弱阳性（+），5~8 分为中等阳性（++），9~12分为强阳性（+++）。

检测人 脑胶质瘤组织中ERK2蛋白表达的标本加适量样品 悬浮缓冲液匀浆，离心，取上清液，按Lowery法 测定蛋白浓度。10% SDS-PAGE分离蛋白质；电泳 后将PAGE凝胶中的蛋白通过电转移槽转移至硝酸 纤维素膜(4℃)。取出膜用丽春红染色，封闭后加 入一抗，4℃过夜，加入二抗，室温2 h，显色。灰 度值(OD值)测定，密度扫描仪(ZEISS全自动图像 分析仪，VIDAS数据分析)测定条带的A值，以A值 代表ERK2蛋白的相对表达量。计算每一患者肿瘤 组织与正常乳腺组织GAPDH值的比值即OD值， 比值>1表示肿瘤中ERK蛋白表达增高，以此比值 反映各患者之间ERK2蛋白表达水平的差异。

应用SPSS11.0统计学软件，计数资料数据以 百分率(%)表示，计量资料数据以（x ±s）表示， 进行χ2检验、组间t检验及Spearman轶相关性分 析，以P<0.05为差异有统计学意义。

ERK2在正常脑组织中低表达16.7%(1/6)，在胶 质瘤组织中有不同程度表达，其在胶质瘤细胞免 疫组织化学染色中主要呈淡黄色、棕黄色或黄褐 色。ERK2在胶质瘤组织中高表达64.30%(27/42)， 与正常脑组织比较，两者间差异有统计学意义 (χ2=32.576,P<0.05)。ERK2在不同病理分级胶质瘤 中阳性表达率分别为Ⅰ级33.3%，Ⅱ级46.2%，Ⅲ级 88.9%，Ⅳ级90.9%，Spearman等级相关分析显示 ERK2表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关(r=0.711, P<0.05)。ERK2在低度恶性胶质瘤(Ⅰ,Ⅱ级)中阳性 表达率为40.9%(9/22)，在高度恶性胶质瘤(Ⅲ,Ⅳ级) 中阳性表达率为90.0%(18/20)，两者间比较差异有 统计学意义(χ2=10.996,P<0.05)，见表 2、图 1。

表 2(Table 2)

表 2 ERK2在正常脑组织和不同级别人脑胶质瘤中的表达 Table 2 ERK2 expression in normal brain tissues and different pathological grades of human glioma

表 2 miR-21及一般临床病理因素在食管癌患者预后中的单因素分析 Table 2 ERK2 expression in normal brain tissues and different pathological grades of human glioma

A: negative expression of ERK2 in normal brain tissues; B:weakly positive expression of ERK2 in subependymoma(WHOⅠ) (+ );C:positive expression of ERK2 in oligodendroglioma (WHO Ⅱ) (++);D:strong positive expression of ERK2 in anaplastic astrocytoma(WHO Ⅲ) (++);E:positive expression of ERK2 in anaplastic oligodendroglioma(WHO Ⅲ) (+++);F:strong positive expression of ERK2 in glioblastoma(WHO Ⅳ) (+++) 图 1 ERK2在正常脑组织和不同级别人脑胶质瘤中的表达 (免疫组织化学 ×200) Figure 1 ERK2 expression in normal brain tissues and different pathological grades of human glioma （IHC ×200）

人脑胶质瘤组织中ERK2蛋白条带深于正常对 照组，见图 2。统计学分析表明，ERK2蛋白在人 脑胶质瘤中过度表达，正常脑组织灰度值（OD 值）为(26.98±1.83)，人脑胶质瘤灰度值（OD 值）,即ERK2/GAPDH为（58.79±14.90），与正 常脑组织相比，其差异有统计学意义 (P<0.05)。 ERK2蛋白在人脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级灰度值（OD值） 为(47.09±9.18)，在人脑胶质瘤中Ⅲ~Ⅳ级为(71.67 ±7.20)，两者比较，表达增高，差异有统计学意义 (P<0.05)。具体数值见表 3。

图 2 Western bolt检测ERK2在正常脑组织和不同级别人脑胶质瘤中的表达 Figure 2 ERK2 expression in normal brain tissues and different pathological grades of human glioma detected by Western blot

表 3(Table 3)

表 3 miR-21及一般临床病理因素在食管癌患者预后中的多因素分析 Table 3 Multivariate analysis of miR-21 expression and general clinicopathologic parameters in the prognosis of EC patients

表 3 在正常脑组织和人脑胶质瘤中ERK2/GAPDH值一览表 Table 3 ERK2/GAPDH value in normal brain tissues and human glioma tissues

ERK2是由Boulton等^{[2, 3]}于90年代初期分离并鉴 定出一种蛋白激酶C-DNA序列，相对分子质量42 kD。ERK2定位于染色体1p34-35，全长3 118 bp， 开放阅读框编码978个氨基酸残基。ERK2肽链的183位苏氨酸和185位酪氨酸均发生磷酸化为该激 酶活化所必须^[4]，其在MAPK途径中不仅作为转录 因子，且是膜蛋白。ERK2激酶家族属于酪氨酸蛋 白激酶，磷酸化才能发挥其活性，激活后作用于 多种转录因子及核蛋白，参与细胞增殖、分化、 迁移、侵袭和凋亡等多种生物学效应。

ERK2(ERK又称为MAPK)，遵循MAPKs三 级酶促级联反应^[5]。ERK2接受上游的级联反应信 号，变成磷酸化EKR(P-ERK)，转位入细胞核， 调节核内某些的转录因子活性，如c-fos、c-Jun、 Elk-1、STATs、c-myc、Max、ATF2和NF-κB等， 这些转录因子进一步调节它们各自靶基因的转 录，引起特定蛋白表达或活性改变，从而参与多种细胞生物学效应(如增殖、分化、转化和凋亡 等)^{[6, 7, 8, 9]}。PD98059是MAPK信号转导通路的特异性 阻断剂，特异地抑制ERK的上游激酶MEK1，通过 与非活性形式的MEK1结合抑制MEK1的激活与磷 酸化^[10]，因而具有阻断ERK2信号通路的作用。

ERK2信号通路，主要是通过影响细胞周期机 制来调节细胞增殖^[11]。Khan等^[12]在研究二十二碳 六烯酸 (docosahexaenoic acid,DHA)在FM3A老鼠 乳腺癌细胞中调节细胞生长增殖过程中作用时发 现ERK2活性受抑制和P27Kip1水平上调，通过作用 参与细胞周期G1-to-S转化调节的CDK2/cy-clin E， 抑制细胞周期末期G1向S期转化，阻止细胞生长 增殖。ERK2的功能是控制细胞分化^[13]，何艳等^[14] 应用Western blot技术检测到经蛇毒神经生长因子 (NGF)处理的PC12细胞，在10 min后ERK2明显磷 酸化而活化；且培养液中加入NGF作用96 h，见 PC12细胞明显分化，出现多个突起；而在NGF作用 前30 min，使用20 μmol/L，PD98059预处理PC12细 胞后，观察到细胞以圆形或椭圆形居多。在侵袭方 面，Piette等^[15]在研究巨噬细胞移动抑制因子(MIF) 在肿瘤细胞生长、侵袭过程中作用时观察到：MIF 通过活化ERK2信号转导途径，来增强神经胶质瘤 U373 MG细胞的迁移和侵袭能力；而地塞米松阻 止神经胶质瘤U373 MG细胞迁移、侵袭过程，是通 过GR受体介导抑制ERK2途径完成的。本研究采用 Western blot技术和IHC方法，检测ERK2在人脑神 经胶质瘤组织和正常人脑组织中的表达，本研究结 果显示：ERK2蛋白在人脑神经胶质瘤组织中高表 达，其阳性表达率与正常脑组织对照组比较差异有 统计学意义(P<0.05)，通过Spearman等级相关分析 显示ERK2表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关。在 Western bolt检测中，从不同级别脑胶质瘤组织中的 表达情况来看，ERK2蛋白在人脑胶质瘤中Ⅲ~Ⅳ级 与Ⅰ~Ⅱ级中，灰度值（OD值）明显增高，差异具 有统计学意义(P<0.05)，并且随着肿瘤恶性程度的 增高其表达强度增加，这一结果与上述国内外研究 结果一致，提示ERK2蛋白的高表达在人脑胶质瘤 细胞异常分化、恶性增殖、侵袭转移等活动中起到 促进作用。

鉴于ERK2在人脑胶质瘤组织中的表达特点及 其表达与胶质瘤细胞异常分化、恶性增殖和侵袭转 移的关系，其将有可能成为反映胶质瘤的恶性程度 和病理分级的有效指标，并成为人脑胶质瘤很有价 值的临床诊断标志物，值得进一步深入研究。