胃肠道肿瘤是最常见的一类恶性肿瘤，化疗 是其治疗的重要手段，目前在临床治疗中，5-氟 尿嘧啶（5-Fu）与铂类药物作为一线化疗药物被 广泛应用。然而，不同的个体对相同药物的反应 不尽相同，造成这种化疗敏感度差异的重要原因 之一是遗传变异，这种个体基因的遗传多态性可 改变化疗药物作用的关键酶的表达及其生物学活 性，从而调节化疗药物代谢与作用靶点的功能，最 终影响个体对化疗的反应性^{[ 1, 2 ]}。大量研究已证实 药物疗效与药物代谢酶和DNA修复酶的基因多态 性之间存在密切相关性^{[ 3, 4, 5 ]}。其中，胸苷酸合成酶基 因（thymidylate synthase,TYMS）和切除修复交叉 互补基因1（excision repair cross-complementing 1, ERCC1）最早引起人们关注^{[ 2,4 ]}。TYMS基因常见的 基因型为3R/3R、2R/3R和2R/2R；ERCC1基因常见 的基因型为C/C、T/T和C/T。一直以来，临床上对 TYMS基因和ERCC1基因多态性检测常选用患者 肿瘤组织，但是由于各种原因，获取肿瘤组织存 在一定困难，导致对目的基因多态性检测存在一 定局限性。近年来国内外有研究^{[ 6, 7, 8, 9 ]}报道，在大肠 癌、直结肠癌等消化道肿瘤患者外周血中检测到 TYMS和ERCC1基因多态性，但是对于胃癌患者 外周血中是否能够检测到TYMS和ERCC1基因多 态性，以及这些基因多态性是否与胃癌组织中存 在一致性，目前尚不清楚。本研究首先检测胃癌 患者肿瘤组织与外周血中TYMS和ERCC1基因多 态性，研究此两种基因在肿瘤组织与外周血中的 多态性是否一致，探究外周血基因多态性检测代 替组织检测的可行性。在此基础上，收集经5-Fu 和铂类药物化疗的消化道肿瘤如大肠癌、胃癌、 结肠癌等患者外周血，研究外周血TYMS基因与 ERCC1基因多态性在评估肿瘤患者化疗疗效中的 作用，为肿瘤患者个体化治疗提供一个简便的实 验室评估检测指标。 1 资料与方法 1.1 资料

选取2012年2月—2012年8月在郑州大学第一 附属医院胃肠外科行胃癌切除术的患者43例,其中 男31例，女12例。肿瘤组织经病理学检查证实均 为胃腺癌，所有患者手术前均未行放疗和化疗， 并采集术前外周血。同时收集76例采用5-Fu和铂 类药物进行化疗的大肠癌、胃癌、结直肠癌等胃 肠道肿瘤患者的外周血，按实体肿瘤的疗效评价 标准（RECIST）对化疗患者的近期疗效进行评 价，分为化疗有效组与无效组，有效组包括完全 缓解（CR）和部分缓解（PR），无效组包括病情 无变化（SD）和病情恶化（PD）。 1.2 方法 1.2.1 外周全血基因组DNA的提取

采用血液基 因组柱式小量提取试剂盒（北京）进行外周全血 基因组DNA的提取。 1.2.2 肿瘤组织基因组DNA的提取

采用UNQ-10 柱式动物组织DNA抽提试剂盒（上海）对所得肿 瘤组织标本进行基因组DNA提取。 1.2.3 PCR法检测TYMS基因型

TYMS基因引 物序列：上游：5’-GCGGAAGGGGTCCTG CCA -3’，下游：5’-CGTGCGGTCGTCCTT CCT G -3’。 反应总体系25 μl，95℃预变性5 min；95℃30 s、 63℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环； 72℃延伸5 min。取5 μl PCR产物电泳30 min，凝胶成像扫描 分析。 1.2.4 PCR-RFLP法检测ERCC1基因型

ERCC1基 因引物序列：上游：5’-TGTGGTTATCAAGGGTC ATCC-3’，下游：5’-CAGTCCAGAACACTGGGA CAT-3’。反应体系25 μl，95℃预变性5 min；95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环；72℃延伸 5 min。将10 μl扩增产物及2 μl Hind Ⅲ内切酶加入 反应管中，37℃水浴4 h后取出，65℃加热5 min终 止反应。消化后行琼脂糖凝胶电泳并观察结果。 1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行统计分析，所得资料 均用样本例数表示，两组间的比较用卡方连续校 正法检验。Spearman进行样本组间相关性分析， Fisher精确检验分析基因型与化疗效果之间的关 系，双侧检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 TYMS和ERCC1基因型与患者临床病理因素 相关性分析

43例胃癌术后患者，TYMS和ERCC1各基因多 态性位点基因型与患者性别、肿瘤部位、肿瘤分 化程度、转移部位个数以及CEA水平方面均无显 著相关性（P>0.05），见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 TYMS和ERCC1基因型与患者临床病理因素的相关性（n=43） Table 1 Correlation of TYMS,ERCC1 genotypes and clinicopathologic factors of gastric cancer patients（n=43）

表 1 TYMS和ERCC1基因型与患者临床病理因素的相关性（n=43） Table 1 Correlation of TYMS,ERCC1 genotypes and clinicopathologic factors of gastric cancer patients（n=43）

由电泳结果可知，TYMS基因3R/3R基因型扩 增片段为296 bp，2R/2R为268 bp，2R/3R基因型同 时存在268 bp与296 bp两种长度片段，扩增结果与 预期结果相一致。TYMS基因各基因型在外周血 和肿瘤组织中的分布见表 2。统计分析显示，外周 血和肿瘤组织中TYMS基因各基因型具有显著相关 性，且各基因型检出率一致，基因型间差别有统 计学意义(P<0.01)，见图 1。

M:marker; 1:2R/3R genotype; 2:2R/2R genotype; 3:3R/3R genotype 图 1 TYMS基因各基因型电泳图 Figure 1 Electrophoretogram of TYMS genotypes

表 2(Table 2)

表 2 外周血和肿瘤组织TYMS基因各基因型频率 Table 2 Genotype frequencies of TYMS in peripheral blood and tumor tissues

表 2 外周血和肿瘤组织TYMS基因各基因型频率 Table 2 Genotype frequencies of TYMS in peripheral blood and tumor tissues

由电泳结果可知，ERCC1基因扩增片段为 240 bp，经酶切之后，C/C基因型片段长度仍为 240 bp，T/T基因型可被酶切为87 bp和153 bp， C/T基因型一部分不被酶切，一部分被酶切为87 bp和153 bp两个片段，其结果显示与预期结果相 一致。ERCC1基因各基因型在外周血和肿瘤组织 中的分布见表 3。统计分析显示，外周血和肿瘤组 织中ERCC1基因各基因型具有显著相关性，且各 基因型检出率一致，基因型间差异有统计学意义 (P<0.01)，见图 2。

M:marker; 1:PCR product of ERCC1 gene; 2:C/C genotype; 3:C/T genotype; 4:T/T genotype 图 2 ERCC1基因各基因型电泳图 Figure 2 Electrophoretogram of ERCC1 genotypes

表 3(Table 3)

表 3 外周血和肿瘤组织ERCC1基因各基因型频率 Table 3 Genotype frequencies of ERCC1 in peripheral blood and tumor tissue

表 3 外周血和肿瘤组织ERCC1基因各基因型频率 Table 3 Genotype frequencies of ERCC1 in peripheral blood and tumor tissue

化疗患者中TYMS基因3R/3R、(2R/2R、 2R/3R)基因型检出率分别为65.79%（50/76）、 34.21%（26/76）。携带3R/3R基因型的患者共50 例，其中CR 0例、PR 9例、SD 14例、PD 27例； 化疗有效组9例，无效组41例，化疗有效率为18% （9/50）；携带（2R/2R、2R/3R）基因型的患者 共26例，其中CR 0例、PR 15例、SD 4例、PD 7 例；化疗有效组15例，无效组11例，化疗有效 率为57.69%（15/26），见图 3。Spearman法分析 TYMS基因5’端非翻译区各基因型与化疗效果之间 显著相关（P<0.01）；Fisher精确检验分析TYMS 基因各基因型与化疗效果之间的差异，2R/3R、 2R/2R基因型携带者化疗效果好于3R/3R基因型携 带者（P<0.01），见表 4。

图 3 TYMS基因各基因型化疗疗效评价 Figure 3 Chemotherapy effects of TYMS genotypes

表 4(Table 4)

表 4 TYMS基因各基因型化疗疗效比较 Table 4 Comparison of chemotherapy effect of TYMS genotypes

表 4 TYMS基因各基因型化疗疗效比较 Table 4 Comparison of chemotherapy effect of TYMS genotypes

化疗患者ERCC1基因C/C、（T/T、C/T）基 因型检出率分别为中63.16%（48/76）、36.84% （28/76）。携带C/C基因型的患者共48例，其中CR 0例、PR 23例、SD 10例、PD 15例，化疗有效组23 例，无效组25例，化疗有效率为47.91%（23/48）； 携带（T/T、C/T）基因型的患者共28例，其中CR 0 例、PR 1例、SD 8例、PD 19例，化疗有效组1例， 无效组27例，化疗有效率为3.57%（1/28）,见图 4。 Spearman分析ERCC1基因各基因型与化疗效果之 间的相关性，显著相关（P<0.01）；Fisher检验法 分析ERCC1基因各基因型与化疗效果之间的差别， C/C基因型携带者化疗效果好于C/T、T/T基因型携 带者（P<0.01），见表 5。

图 4 ERCC1基因各基因型化疗疗效评价 Figure 4 Chemotherapy effects of ERCC1 genotypes

表 5(Table 5)

表 5 ERCC1基因各基因型化疗疗效比较 Table 5 Comparison of chemotherapy efficacy of ERCC1 genotypes

表 5 ERCC1基因各基因型化疗疗效比较 Table 5 Comparison of chemotherapy efficacy of ERCC1 genotypes

TYMS基因位于第18号染色体上（18p11.32），长 16 kb，其主要转录起始位点位于起始密码子上游 160~180 bp。现已发现，TYMS基因非翻译区中存 在多态性，即5’非翻译区存在一个28 bp串联重复 序列，根据串联重复序列数目的不同，主要分为 重复两次的2R型和重复三次的3R型，因此，最常 见的基因型为3R/3R、2R/3R和2R/2R^{[ 10 ]}。TYMS 基因影响化疗效果的具体作用机制如下：TYMS 基因表达产物胸苷酸合成酶是叶酸循环中起中心 作用的酶类之一，可将脱氧尿苷酸转变成脱氧 胸苷酸，后者是DNA合成和修复所需胸苷酸唯 一来源，抑制胸苷酸合成酶可导致细胞内胸苷酸 减少，染色体断裂，进而导致细胞死亡。同时， TYMS基因的表达产物是5-Fu发挥作用的重要靶点 之一，此酶在体内的含量可直接影响5-Fu的抗瘤 效应。TYMS在5’非翻译区的多态性可影响mRNA 稳定性和翻译效率，进而影响表达，导致患者体 内TYMS基因表达量的差异，从而改变个体对化疗 药物的敏感度。 3.2 TYMS与胃肠道肿瘤

研究发现，TYMS基因3R/3R基因型患者胸苷 酸合成酶的水平高于2R/3R和2R/2R基因型，且临 床表现也明显严重于后者^{[ 11 ]},说明3R/3R基因型是 肿瘤辅助化疗的危险因素。Morganti等^{[ 12 ]}在对48例 消化道肿瘤患者的研究中发现，携带3R/3R基因型 的患者体内TYMS mRNA表达水平显著高于携带 2R/2R和2R/3R基因型患者。早在2005年时，Yawata 等^{[ 13 ]}提出TYMS拷贝数可作为五氟尿嘧啶药物敏感 度的预测指标。而后Brody等^{[ 14 ]}和Watson等^{[ 15 ]}证实 TYMS基因的5’端28bp核苷酸片段重复多态可影响 5-Fu在肿瘤患者体内的反应。Huang等^{[ 16 ]}通过对116 例以5-Fu为基础化疗的胃癌患者的研究，也得出了 相似结论。 3.2.1 TYMS与胃癌

Cui等^{[ 17 ]}指出中国胃肠道癌 症患者中TYMS基因2R/3R携带者对5-Fu的化疗敏 感度高于3R/3R携带者。 3.2.2 TYMS与结直肠癌

Villafranca等^{[ 18 ]}研究65 例直肠癌患者TYMS基因显示：2R/3R和2R/2R基因 型的化疗降期率较3R/3R基因型的高，且2R/3R和 2R/2R基因型与3R/3R基因型3年无病生存率分别为 81%和41%。Pullarkat等^{[ 19 ]}、Marsh等^{[ 20 ]}、Park等^{[ 21 ]}、 Matasui等^{[ 22 ]}研究表明，TYMS基因2R/2R,2R/3R基 因型对5-Fu化疗敏感度好于3R/3R基因型。本研究 在对TYMS各基因型与5-Fu化疗效果关系的研究中 发现，携带TYMS基因3R/3R基因型的患者化疗有 效率为18%，而携带2R/2R和2R/3R基因型的患者 化疗有效率为57.69%，明显高于前者，说明TYMS 重复序列多态性可作为肿瘤降期的预测指标及预 测5-Fu为基础化放疗方案疗效的新手段。 3.3 ERCC1基因概述

ERCC1即切除修复交叉互不基因，位于第19 号染色体上（19q13.2），全长15 kb，含10个外显 子，其最常见且最有意义的多态性是位于第4号外 显子的第118号密码子中C→T的转变，其基因型可 分为三种：C/C、C/T、T/T。大量研究表明^{[ 23, 24, 25, 26 ]}， 携带C/C基因的患者对铂类药物敏感度更高，即 C/C基因型的出现可减低细胞中ERCC1基因的转录 效率及蛋白表达水平，最终减弱ERCC1的DNA修 复能力，进一步影响个体对铂类药物的敏感度； 而DNA损伤修复能力是改变铂类药物疗效的分 子基础，在铂类药物耐药机制中起着关键作用， ERCC1基因表达产物是DNA损伤修复中的关键酶 类之一，与铂类药物抵抗明显相关。 3.4 ERCC1与胃肠道肿瘤

Won等^{[ 27 ]}通过对接受以奥沙利铂为主的一线 化疗的胃癌患者的研究认为，用ERCC1 C118T基 因多态来预测化疗药物的毒性是可行的。刘永萍 等^{[ 28 ]}研究也证实了ERCC1基因多态性可作为预测 以奥沙利铂为主的化疗疗效的可靠因素。2011年 时，Yin等^{[ 29 ]}在对以奥沙利铂化疗为主的胃癌和大 肠癌研究中指出，ERCC1 C118T可作为以奥沙利 铂为主的治疗预测因子。 3.4.1 ERCC1与胃癌

刘永萍等^{[ 28 ]}指出外周血 ERCC1 C/C基因型胃癌患者接受含奥沙利铂方案 辅助化疗生存可能获益。但Ruzzo等^{[ 30 ]}认为C/T,T/T 基因型化疗效果好于前者，但该作者在文章末尾 也指出此结论与大部分文献结论冲突的原因可能 是研究的样本量太小，加之实验的回顾性本质以 及临床情况的异质性。 3.4.2 ERCC1与结直肠癌

Ruzzo等^{[ 31 ]}、贺文兴 等^{[ 9 ]}认为结直肠癌患者ERCC1基因C/C基因型化疗 敏感度优于C/T和T/T基因型。然而，与此同时也 有少数报道与此结论相悖，Viguier等^{[ 32 ]}认为携带 ERCC1 T/T的结直肠癌患者更容易对5-Fu和铂类化 疗药敏感。

本研究在对ERCC1各基因型与铂类药物化疗 效果关系的研究中发现，携带ERCC1基因C/C基 因型的患者化疗有效率为47.91%，而携带T/T和 T/C基因型的患者化疗有效率为57.69%，明显低于 前者，ERCC1各基因型与铂类药物化疗效果差异 有统计学意义，患者体内ERCC1基因型的差异导 致其对铂类药物的敏感度不同，表明肿瘤敏感基 因ERCC1的基因多态性可用于评估铂类药物的疗 效。根据基因型的不同，调整化疗药物，针对可 高表达ERCC1的基因型，选择性地使用高表达耐 药逆转剂，提高抗瘤效果。

然而，临床上某些携带TYMS基因2R/3R,2R/ 2R基因型和ERCC1基因C/C基因型的患者疗效并非 和预期疗效完全相符，提示可能存在其他因素对 化疗效果的影响，如年龄、饮食、器官功能等。