食管癌是最常见的八大恶性肿瘤之一，其致 死率在恶性肿瘤中排第六位，在我国食管癌的死 亡率约为17.38/10万^[1]。食管癌多隐匿性起病，大 多数患者就诊时已处于中晚期。虽然目前对食管 癌采取了手术、化疗与放疗相结合的综合治疗方 式，但五年生存率仍只有15%~25%，约75%的患 者多在确诊后一年内死亡^{[1, 2]}。因此，提高食管癌 早期诊断率以降低其死亡率，寻找更有效的生物 学标志物是十分必要的。

微小RNA (microRNA,miRNA) 是一类内源 性的单链非编码小分子RNA，约17~25 bp大小， miRNA主要是通过与靶基因mRNA 3’-UTR结合， 导致靶基因mRNA降解或转录后翻译抑制，从而 调控靶基因的表达^[3]。大量研究表明，miRNA在 肿瘤细胞的生物学行为以及肿瘤的发生发展中发 挥重要作用,包括细胞的增殖、分化、侵袭、凋亡 和转移等^[4]。目前研究发现，miR-21在多种人肿瘤 细胞中均有较高的表达，并影响肿瘤细胞的生物 学行为^{[5, 6]}。本文作者通过实时定量PCR方法检测 miR-21在食管鳞癌组织和周围正常食管组织中的 表达，并分析其与临床病理之间的关系。

本研究中72例食管癌患者的肿瘤组织和邻近 正常食管组织样本由湖北省肿瘤医院在2004年3月至2008年12月间活检或手术切除取得，所有患 者术前均未行放疗和化疗。临床资料和相关病理 信息从患者的病历和本院病理报告中获得。所有 患者均知晓其资料信息用于本实验研究，见表 1。 其中，男40例，女32例，年龄35~67岁，平均年龄 51.5岁。胸上段食管癌13例，中段35例，下段24 例。组织学为低分化16例，中分化22例，高分化34 例。术中取肿瘤中心（去除坏死组织后）及距肿 瘤边缘至少5 cm的食管切缘组织，病理确认食管残 端为正常食管黏膜上皮，组织类型均为鳞癌。本 研究中所有患者均获随访,随访从手术后第一天开 始，以患者死亡或失随访的时间为截止时间，至 2012年3月止，时间1~72月，平均为37.5月。

采用SPSS18.0软件进行处理，组间差异通过t 检验和χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier和Cox 回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

运用实时定量P C R 方法检测所有组织中 miR-21的表达，结果表明miR-21在所有组织中均 有表达，且在72例食管癌组织中有63例miR-21的 表达，明显高于邻近的正常食管组织，两者之间 差异有统计学意义 (P=0.001)，见图 1。

图 1 miR-21在食管癌和正常食管组织中的表达 Figure 1 miR-21 expression in 72 pairs of EC and adjacent normal esophageal tissues detected by quantitative realtime polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis

2.2 miR-21的表达与食管癌患者临床病理之间的关系

根据miR-21表达的中位值[（7.562±1.072）， 内参为U6]，将72名患者分为两组，其中高表 达组46例，低表达组26例。经统计分析发现， miR-21的表达与患者的肿瘤TNM分期和进展恶化 明显相关，患者miR-21表达越高，TNM分期越晚 （P=0.023），恶化的可能性越高（P=0.025）。而 与患者的性别、发病年龄、肿瘤的部位、肿瘤组织 类型以及分化程度无关，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 miR-21在食管癌组织中的表达及其与临床病理因素之间的关系 Table 1 Association between miR-21 expression and conventional clinicopathologic parameters in 72 EC patients

表 1 miR-21在食管癌组织中的表达及其与临床病理因素之间的关系 Table 1 Association between miR-21 expression and conventional clinicopathologic parameters in 72 EC patients

2.3 miR-21在食管癌患者预后中的意义

在随访中，我们定义术后肿瘤复发或/和发生 转移为恶化，通过对比复查时CT与术前CT的表现 来进行判定。在随访过程中，有26例患者发生恶化，其中21例是miR-21高表达患者，5例是miR-21 低表达患者。高表达组5年生存率为15.22%，低表 达组为38.46%。根据Kaplan-Meier生存分析表明， 高表达miR-21的食管癌患者相比低表达的患者5年 生存率更低（P=0.004），见图 2；同时发现TNM 分期越晚（P=0.005）、病情恶化（P=0.011）的患 者5年生存率越低，见表 2。

图 2 食管癌患者miR-21表达和生存时间之间的关系 Figure 2 Correlation between miR-21 expression and survival time in 72 EC patients

表 2(Table 2)

表 2 miR-21及一般临床病理因素在食管癌患者预后中的单因素分析 Table 2 Univariate analysis of miR-21 expression and general clinicopathologic parameters in the prognosis of EC patients

表 2 miR-21及一般临床病理因素在食管癌患者预后中的单因素分析 Table 2 Univariate analysis of miR-21 expression and general clinicopathologic parameters in the prognosis of EC patients

进一步多元Cox回归分析表明，miR-21表达 （P=0.042）、TNM分期（P=0.002）和病情恶化（P=0.009）均是食管癌患者预后的独立指标，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 miR-21及一般临床病理因素在食管癌患者预后中的多因素分析 Table 3 Multivariate analysis of miR-21 expression and general clinicopathologic parameters in the prognosis of EC patients

表 3 miR-21及一般临床病理因素在食管癌患者预后中的多因素分析 Table 3 Multivariate analysis of miR-21 expression and general clinicopathologic parameters in the prognosis of EC patients

3 讨论

miRNAs最早由Lee等^[7]在秀丽隐杆线虫中首 次发现。目前超过1 000种miRNA被发现，其在动 物、植物和病毒中广泛表达。在动物体内miRNA 主要通过与靶基因3’端非编码区(3’-UTR)不完全 配对，从而抑制靶基因mRNA翻译来参与细胞分 化、增殖、侵袭、凋亡等生物学过程^{[8, 9]}。近年大 量研究发现miRNA在多种恶性肿瘤组织中与其相 应正常组织表达存在显著差异^{[10, 11]}，同时大量研 究表明miRNA在肿瘤中的表达高低与肿瘤的发生 发展有密切关系^{[12, 13]}。

目前发现多种miR在食管癌中均有明显的表 达，与食管癌的发生发展有密切关系^[14]。同时， 最近研究证实miR-21是唯一在多种实体肿瘤肺 癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌 等中高表达的miRNA。但关于miR-21与肿瘤临床 病理因素之间关系的研究少有报道。本实验中运 用实时定量PCR方法检测miR-21在食管癌组织和 邻近正常食管组织中的表达，证实了miR-21在食 管癌组织和周围相邻正常食管组织中表达存在明 显差异，且miR-21在食管癌组织中也呈明显的高 表达，该结论与以前的一些相关研究一致^{[5, 6, 15]}。 在miR-21对肿瘤发生发展机制研究方面也有较多 的报道，Ziyan等^[5]也证实在骨肉瘤MG-63细胞中 miR-21通过直接作用RECK基因促进肿瘤的侵袭和 转移。Song等^[15]发现在乳腺癌细胞中miR-21通过 调节TIMP3基因来调节乳腺肿瘤细胞的侵袭。

通过术后的随访统计结果，发现高表达 miR-21的患者有着更差的预后，说明miR-21可以 作为食管癌患者一个有效预后的指标。同样在其 他研究中也有类似的报道，Gu等^[10]发现miR-372 的高表达与肝癌患者术后生存时间存在明显的正 相关。同样在膀胱癌患者中减少的miR-31表达也 证实和术后生存时间缩短有明显的关系^[12]。近期 Markou等^[16]报道miR-21高表达可以作为非小细胞肺癌患者总生存率一个独立的预后因素。

肿瘤的形成是一个非常复杂的过程,包括从 起初的基因改变引起的恶性转变到最后的肿瘤形 成，甚至远处转移。在这些过程中，不同的肿瘤 都有着独特的分子事件，因此肿瘤的预后往往 取决于不同基因之间的相互作用。Qian等^[17]发现 miR-21在344例乳腺癌病例中均有表达,但高表达 的miR-21与患者预后无明显相关性。同样，在食 管癌形成的过程中，miR-21并不是唯一一个发生 改变的基因，因此进一步研究的重点是发现更多 发生改变的基因，研究他们相关的机制，从而为 更好理解食管癌的发生发展以及为预后提供理论 支持。

总之，在本研究中发现miR-21在食管癌组织 的表达明显高于邻近正常食管组织，高表达的 miR-21与食管癌的进展和预后呈明显的相关性。 miR-21可作为食管癌患者总生存率一个独立的预 后因素。