近年来，我国乳腺癌的发病率呈增长趋势。 乳腺癌的病因尚未完全清楚，但有研究表明， 细胞骨架连接质膜蛋白 [solute carrier family 9 (sodium/hydrogen exchanger),member 3 regulator 1,SLC9A3R1]与肿瘤尤其是乳腺癌的进展有密 切关系^{[ 1, 2 ]}，若抑制SLC9A3R1高表达的乳腺癌 细胞系T47D和MCF7中的SLC9A3R1表达，乳腺 癌细胞的增殖能力增强^{[ 3 ]}。磷酸化肿瘤抑制基因 PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten)是一个抑癌基因，具有磷酸酶的 活性，可参与细胞周期调控、促进细胞凋亡及抑 制肿瘤的发生。SLC9A3R1的表达可影响PTEN蛋 白的表达，并通过影响其相关信号转导通路进一 步影响乳腺癌的恶性表型^{[ 4 ]}。SLC9A3R1基因突变 是否是乳腺癌恶性表型发生的主要原因，目前还 没有明确报道。MDA-MB-231细胞中的SLC9A3R1 基因发生突变几乎不表达SLC9A3R1，因此恶性 程度高且具有很强的迁移能力^{[ 5 ]}。为了明确这些特 性是否与SLC9A3R1基因的突变有密切关系，本 研究在SLC9A3R1基因突变的MDA-MB-231乳腺 癌细胞系中，通过转染SLC9A3R1质粒并用G418 筛选，获取稳定表达SLC9A3R1的细胞系，观察 SLC9A3R1过表达是否可使其恶性表型(不受控制 的细胞生长和侵袭转移行为)发生逆转，恢复正常 表型。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 菌株E. coli DH5α、MDA-MB-231细胞、真核表 达质粒pBK-CMV-HA和重组表达质粒pBK-CMVHA- SLC9A3R1wt为天津市放射医学与分子核医学 重点实验室保存和构建。

各种限制性内切酶购自Takara公司。1640培 养液、小牛血清和青/链霉素购自Hyclone公司。 FuGENE转染试剂购自Roche公司。anti-HA抗体购 自MBL公司。HRP标记的羊抗鼠和羊抗兔二抗均 购自北京中杉金桥公司。ECL化学发光试剂盒购 自Pierce Biotech公司。CCK-8试剂盒购自上海同仁 化学研究所。低熔点琼脂糖购自Invitrogen公司。 凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公 司。其他试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 真核表达载体的构建

质粒的提取、酶切及DNA片段的回收、连接 和转化参照Pan等^{[ 3 ]}的方法进行。将表达载体pBKCMV- HA和已连接于T载体的SLC9A3R1-wt片段分 别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切成粘端，凝胶电泳后切 胶回收，连接，转化大肠杆菌DH5α，抗性筛选。 获取阳性克隆后，提取质粒进行测序，确证所得 的pBK-CMV-HA-SLC9A3R1-wt阳性克隆具有正确 的序列及读码框。 1.2.2 细胞培养及稳定转染细胞系的建立

MDA-MB-231细胞在含10%小牛血清及1%青 霉素和链霉素的1640培养液中，于37℃、5%CO2 的培养箱中培养。

以2 μg重组质粒DNA通过FuGENE介导转 染MDA-MB-231细胞，用含有浓度为350 μg/ml G418(Geneticin，庆大霉素的氨基糖苷)的筛选培养 基筛选3~4周后得到抗性细胞克隆。消化分离后用 G418的维持培养液进行培养和传代。 1.2.3 细胞生长曲线测定(酶标仪Molecular Devices， SPECTRA max M2，450 nm波长)

细胞接种于96孔板，每孔细胞数为2.5×10³ 个。每隔24 h以CCK-8试剂盒测定细胞数，连续测 定7 d，每次设置4个平行样本，至少重复3次。 1.2.4 Western blot检测

取各组细胞裂解液20 μl，经8% SDS-PAGE电 泳后，转移到硝酸纤维素膜上，封闭1 h。抗HA 抗体4℃过夜，偶联有辣根过氧化物酶的羊抗兔二 抗室温反应1 h，采用ECL显色方法进行显色。用 Image J图像分析系统对Western blot实验结果进行 分析。 1.2.5 集落形成分析(soft agar assay)

用三蒸水分别制备1.2%和0.7%两个浓度的低 溶点琼脂糖液体，高压灭菌后，40℃维持，使之 保持溶解状态。无菌制备2×1640培养液(含2×抗 生素和20%小牛血清)，保存在37℃中。按1:1混合 1.2%的琼脂糖和2×1640培养液后，取1 ml混合液 注入直径35 mm的培养皿中，待冷却凝固后，置 入培养箱中备用。消化指数增殖期的细胞，用培 养液制成细胞悬液，计数。按1:1比例将0.7%琼脂 糖和2×1640培养液在无菌试管中混合后，再向管 中加入0.2 ml单细胞悬液，充分混匀、注入已铺有 1.2%琼脂糖的培养皿中，加入量同上，每皿接种 5 000个细胞，待上层琼脂糖凝固后，置入培养箱 中，培养10~14 d。LEICA DMIRB显微镜观察细胞 克隆形成情况，计数直径>25 μm的集落，3复孔算 均值，集落形成率=集落数/接种细胞数×100%。 1.2.6 细胞凋亡分析

Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪分析检测 细胞凋亡率。接种细胞后24 h收集并洗涤细胞，以 500 μL结合缓冲液悬浮细胞，加入10 μL Annexin V-FITC混匀，室温避光反应10 min，加入5 μL PI 混匀，室温避光反应5 min，1 h内用流式细胞仪 (BECKMAN COULTER Cell，EPICS XL)分析。

以上所有实验重复3次。 1.3 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件分析结果。生长曲线 测定结果用重复测量t检验进行分析。集落形成和 凋亡结果采用独立样本t检验进行统计学分析。 P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 稳定转染MDA-MB-231细胞系的Western blot 法鉴定

分别将转染了pBK-CMV-HA-SLC9A3R1重组 质粒及pBK-CMV-HA载体的MDA-MB-231细胞 接种于35 mm细胞培养皿，接种数为1×10⁶，待细 胞贴壁后用上样缓冲液刮取细胞并超声裂解，取 10 μl经8% SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维 素膜上，通过HA抗体进行蛋白质印迹实验，用 Image J图像分析系统对Western blot实验结果进行 扫描分析，确保获得稳定表达SLC9A3R1的阳性 克隆，见图 1。将空载细胞命名为HA231，将含有 SLC9A3R1蛋白的细胞命名为E231。

1:cells tranfected with vector-HA231;2:cells transfected with recombinant plasmid-E231 图 1 Western blot检测SLC9A3R1在MDA-MB-231细胞系 的稳定表达 Figure 1 Stable SLC9A3R1 expression in MDA-MB-231 cell line detected by Western blot

CCK-8试剂盒测试结果显示，SLC9A3R1可使 MDA-MB-231细胞的增殖能力明显减弱，达50% 以上。E231细胞与低表达SLC9A3R1的231及空载 对照HA231相比，第5、6及7天均有明显差异(第5 天P=0.0016，第6天P=0.002，第7天P=0.006)，而 231细胞与HA231相比，在实验天数内没有差异， 见图 2。

*:P<0.01,the proliferative ability of E231 cell with SLC9A3R1 overexpression was significantly inhibited,compared with either 231 cells or HA231 cells,especially on day 5,6 and 7 图 2 稳定表达SLC9A3R1的MDA-MB-231细胞系的生长 曲线 Figure 2 Growth curves of MDA-MB-231 cell line with stable SLC9A3R1 expression

软琼脂集落形成实验结果表明，MD A - MB-231细胞、整合了空载体的细胞和整合了 SLC9A3R1的细胞集落形成率分别为(2.9±0.47)%、 (2.52±0.08)%和(1.33±0.33)%。表明SLC9A3R1过 表达可使MDA-MB-231细胞系锚定无关的增殖能 力(anchorage-independent growth)明显减弱，达 47%(P=0.007)。 2.4 SLC9A3R1过表达的MDA-MB-231细胞系凋 亡百分比的变化

将HA231细胞和E231细胞接种于90 mm的培 养皿，过夜培养，用Annexin V-FITC/PI双染方法 结合流式细胞仪对其凋亡细胞百分比进行检测， 共进行3次独立实验。选其中典型凋亡结果见图 3。结果显示，所检测的细胞坏死率均较低，符 合凋亡检测所要求的坏死比率。整合了空载体的 MDA-MB-231细胞和整合了SLC9A3R1的细胞凋亡 百分比分别为(2.23±1.41)%和(9.23±2.97)%。表明 SLC9A3R1过表达可使MDA-MB-231细胞系凋亡百 分比明显增多，见图 3，达4倍以上 (P=0.018)。

图 3 稳定表达SLC9A3R1的MDA-MB-231细胞系凋亡百分比 Figure 3 Apoptosis percent of MDA-MB-231 cell line with stable SLC9A3R1 expression

随着我国乃至全球乳腺癌发病率和死亡率的 增加，人们对乳腺癌发病机制和治疗的研究日益 深入。各种证据表明，SLC9A3R1与肿瘤发生发展 关系密切，可能是一个潜在的抑癌蛋白^{[ 6 ]}，尤其在 乳腺癌中^{[ 2, 3 ]}。近期有研究指出，利用SLC9A3R1蛋 白的表达情况可提高预测Ⅱ级侵袭性乳腺癌临床结 果的准确性，对于乳腺癌的诊断有显著作用^{[ 2, 3 ]}。 细胞质内SLC9A3R1蛋白表达水平的改变在确定肿 瘤发生、发展及侵袭程度方面扮演重要角色。此 外，SLC9A3R1蛋白的过表达还与肿瘤组织学等级 的增加、临床症状的加重、预后不良及肿瘤组织 缺氧的严重程度有关^{[ 2, 7, 8 ]}。因此，证实SLC9A3R1 是抑癌蛋白将为肿瘤的诊断、治疗和药物研发提 供新靶标。在各种乳腺癌细胞系中，SLC9A3R1的 表达水平差异较大。抑制SLC9A3R1高表达的乳腺 癌细胞系中的SLC9A3R1表达后，可明显促进乳腺 癌细胞的增殖能力^{[ 3,8 ]}。而将SLC9A3R1表达质粒转 入SLC9A3R1表达缺失的乳腺癌细胞，是否可减缓或 逆转乳腺癌细胞的恶性表型是本研究的主要目的。

SLC9A3R1作为一种细胞支架蛋白，其功 能将会由于结合蛋白的不同而具有明显的多样 性。SLC9A3R1抑癌作用的分子机制也较为多 样。SLC9A3R1能够与质膜上不同部位的膜受体 结合；SLC9A3R1能够在细胞间黏附连接(adherens junctions,AJs)处与EGFR和NF2形成蛋白复合体^{[ 9 ]}， 从而阻止EGFR的内化和信号转导；SLC9A3R1也能 与PDGFR结合，并且和NF2形成信号转导复合体^{[ 10 ]}， 减弱PDGFR的信号转导。而活化的PDGF信号能够 阻止细胞在上皮细胞向间质细胞的转变过程中发 生凋亡，促进乳腺癌的发展和转移^{[ 11 ]}。PTEN抑癌 蛋白是一种磷酸肌酸磷酸酶，能够拮抗磷脂酰肌 醇3磷酸激酶PI3K^{[ 12 ]}，SLC9A3R1在鼠胚成纤维细 胞^{[ 7 ]}和乳腺癌细胞^{[ 13 ]}中结合PDGFR和PTEN抑癌蛋 白，形成信号转导复合体，从而抑制PDGFR的信 号转导，同时可促进细胞凋亡。由SLC9A3R1介导 形成的信号转导复合体在PDGF刺激下抑制了PI3K 通路的活性。

某些乳腺癌细胞系如T47D、MCF7中，本身 即存在SLC9A3R1的表达，但并未体现出肿瘤抑制 作用，如果SLC9A3R1的表达被抑制后，这些细胞 系的恶性表型都得到明显的增强^{[ 3 ]}。表明这些肿瘤 细胞系中SLC9A3R1的表达水平并未达到抑制肿瘤 增殖的水平。此外，已发现SLC9A3R1有30多种 结合蛋白^{[ 14 ]}，而这些肿瘤细胞中较低的SLC9A3R1 表达水平将会导致它无法与肿瘤抑制蛋白结合， 难以发挥它的抑癌功能。另一个原因则可能是不 同的细胞系和组织具有不同的遗传背景，即使 SLC9A3R1达到了相同的表达水平，在不同的遗传 背景下，SLC9A3R1也可能会与不同的结合蛋白结 合，而产生不同的功能。

本实验所采用的MDA-MB-231乳腺癌细胞系 不表达SLC9A3R1，我们通过质粒转染使其表达 SLC9A3R1。结果表明SLC9A3R1过表达能够抑 制肿瘤细胞的增殖。SLC9A3R1过表达的MDAMB- 231细胞增殖速度要低于空质粒转染组。同 时，在软琼脂中，SLC9A3R1过表达的细胞系比 MDA-MB-231细胞和转染了pBK-CMV-HA空质粒 的细胞集落形成率明显降低，表明SLC9A3R1过表 达能够抑制乳腺癌细胞的锚定非依赖生长。本实 验并未发现SLC9A3R1可导致明显的细胞周期阻 滞，但在SLC9A3R1过表达细胞的G1峰前出现亚 G1峰，表明SLC9A3R1可能诱导了细胞的凋亡。进 一步的实验表明，SLC9A3R1的确造成了细胞凋亡 比例的上升。细胞凋亡与细胞增殖、分化都是细 胞的基本生命活动，三者密切相关，其平衡失调 与肿瘤的发生发展有关^{[ 15 ]}。细胞凋亡在肿瘤的发 生发展中主要起负调控作用，可抑制肿瘤细胞生 长。因此本研究表明SLC9A3R1可能是通过促进肿 瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增殖的。Pan等^{[ 3 ]}的研 究表明，抑制SLC9A3R1表达将促进细胞的G1~S周 期转换和增强乳腺癌细胞的cyclin E的表达，使细 胞增殖能力增强。此结论与本研究的实验结果可 相互佐证。

总之，本研究表明SLC9A3R1过表达可显著 抑制MDA-MB-231细胞的恶性生物学行为(增殖能 力、集落形成能力)，此结果与Pan^{[ 3 ]}和Takahashi^{[ 7 ]} 的结果一致。此外，SLC9A3R1过表达可显著促 进MDA-MB-231细胞的凋亡。因此，有理由认为 SLC9A3R1具有抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增 殖的作用，并且其抑制乳腺癌增殖的作用与促进 MDA-MB-231细胞凋亡有关。尽管我们能够通 过生长因子及其受体与SLC9A3R1抑癌蛋白形成 复合体或是促进β-catenin蛋白稳定于膜表面来解 释SLC9A3R1抑制肿瘤增殖的作用^{[ 16, 17 ]}，但尚需 研究其他相关跨膜配体，因为它们同样可能增强 SLC9A3R1的抑癌作用。综上所述，本研究结果进 一步明确了SLC9A3R1的抑癌作用，有望成为一种 候选乳腺癌抑制蛋白，为乳腺癌的临床治疗提供 新的药物靶标。