实质性肿瘤细胞过度增殖可导致肿瘤内部及其周围受压形成缺氧，从而使得肿瘤细胞的迁移 及浸润能力增加^{[ 1 ]}，但持续缺氧又可导致肿瘤细 胞死亡。肿瘤细胞为适应缺氧而发生一系列生物 学改变，其中HIF-1α是促进这一系列改变的关键 性调控因子。近年来自噬成为肿瘤治疗研究的热 点，肺癌细胞可能通过自噬机制保护其生存，避 免凋亡，但另一方面，自噬也可能诱导肺癌细 胞发生自噬性细胞死亡从而促进肺癌的逆转。目 前，阻断表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路被认为是治疗非 小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的 关键靶点，口服EGFR小分子抑制剂吉非替尼是 NSCLC靶向治疗的代表药物。本实验研究吉非替 尼作用于缺氧条件下肺腺癌A549细胞时HIF-1α与 自噬表达的变化以及肺癌细胞凋亡水平的变化， 探讨他们在肺癌靶向治疗中的关系。 1 材料与方法 1.1 细胞与试剂

实验细胞株： 人肺腺癌A5 4 9 细胞株，由 苏州大学南校区免疫实验室提供，吉非替尼 （Gefitinib，商品名：Iressa /易瑞沙），美国阿斯 利康公司产品，剂型：250 毫克/片，HIF-1α 鼠抗 人单克隆抗体 sc-53546（SANTA CRUZ公司）， LC3B Protein（Human）ab62721抗体（英国Abcam 公司），Beta-actin抗体（碧云天生物技术研究 所），HRP标记鼠抗兔IgG（碧云天生物技术研 究所），碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）美国 Sigma公司，细胞周期检测试剂盒（联科生物技术 有限公司），Annexin V-FITC及细胞凋亡检测试剂 盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。 1.2 实验设计和方法 1.2.1 吉非替尼准备

吉非替尼片剂用细胞培 养液和DMSO溶解，配制成25 mg/ml的药品混悬 液，-20℃冰箱保存，实验配制50 μg/ml DMEM培 养液。 1.2.2 分组与处理

人肺腺癌A549细胞以每毫升 3×10⁵个传代培养后分组：（1）常氧组（C组）： 37℃、5%CO₂，21%O₂；（2）吉非替尼组（G 组）：Gefitinib（50 μg/ml）处理；（3）缺氧组 （H组）：37℃、5%CO₂，1%O₂；（4）吉非替尼 +缺氧组（G + H组）：50 μg/ml Gefitinib +1%O₂。 1.2.3 细胞检测 按上述分组分别处理A549细 胞24 h后，（1）Western blot检测HIF-1α蛋白及 MAPLC3-Ⅱ蛋白表达水平：用蛋白裂解液裂解 细胞后，提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定法 测定蛋白浓度，并根据测蛋白浓度稀释样品蛋白 （蛋白定量），随后取样品蛋白40 μg，电泳分离、 转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜后洗 涤，二抗室温孵育1 h后洗涤，ECL法显色，标定 Marker，进行分析与扫描；（2）透射电子显微镜 观察A549细胞胞质内自噬小体数量的变化：将4组 A549细胞分别固定于4%戊二醛中，梯度脱水、包 埋、切50~70 nm薄片，醋酸双氧铀、柠檬酸铅双 染（整个操作过程均在冰上进行），电子显微镜 观察A549细胞内自噬的产生及变化；（3）流式 细胞术检测细胞凋亡率：分别收集4组A549细胞， 每组细胞加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，之 后加入5 μl Annexin V-FITC混匀，再加入5 μl PI混 匀，室温、避光、反应15 min，1 h内流式细胞仪 上检测细胞凋亡率。 1.3 统计学方法

数据以±s表示，各组间比较采用单因素方差 分析，两组间比较采用配对t检验，以P<0.05为差 异具有统计学意义，统计学分析均应用IBM SPSS 19.0统计软件处理。 2 结果 2.1 各组HIF-1α蛋白表达的变化

HIF-1α蛋白检测显示：C组和G组基本无表 达，分别为（0.24±0.05）和（0.11±0.03），考 虑为A549细胞在常氧培养过程中部分细胞缺氧 所致干扰，H组（0.78±0.04）较C组表达显著增 加（1.34±0.08），G+H组表达较H组下降(P均 <0.05)，见图 1。

C:control group (21% O2); G:Gefitinib group (50μg/ml Gefitinib): H: hypoxia group (1% O2)；G + H:Gefitinib + hypoxia group (50μg/ml Gefitinib +1% O2) 图 1 各组HIF-1α蛋白表达的变化 Figure 1 HIF-1α expression in each group

MAPLC3-Ⅱ的含量与自噬泡的数量呈正相 关，是自噬体的特异性标记蛋白。MAPLC3-Ⅱ 蛋白检测显示：C组为（0.85±0.06），G组和H组 分别为（1.32±0.03）和（1.62±0.05），均较C组 增高，G+H组（1.97±0.04）较C组明显增高 (P均 <0.05)，见图 2。

LC3-Ⅰ:MAPLC3-Ⅰ(microtubule-associated protein 1light chain3-Ⅰ); LC3-Ⅱ:MAPLC3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1light chain3-Ⅱ); 图 2 各组MAPLC3-Ⅱ蛋白表达的变化 Figure 2 MAPLC3-Ⅱexpression in each group

透射电子显微镜是检测自噬最为可靠的方法 和“金标准”。C组细胞结构清晰，自噬小体散在可 见；G组和H组细胞内自噬比较活跃，G+H组胞质 内可见线粒体嵴断裂且肿胀变形、空泡化。G组、 H组和G+H组的自噬小体数量均较C组明显增多， 见图 3。

图 3 透射电子显微镜观察A549细胞胞质内自噬小体数量的变化 Figure 3 Quantity change of autophagy bodies in A549 cell observed by transmission electron microscope

C组细胞凋亡率为（7.20±1.80）%，G+H组 （34.4±3.95）%较C组显著增加，且较G组和H组 [（20.03±1.12）%和（16.77±1.15）%]均明显增高 (均P<0.05)，见图 4。

图 4 FCM检测不同处理后A549细胞凋亡率变化 Figure 4 Cell cycles and apoptotic rates of A549 cell detected by flow cytometry

既往研究证实HIF-1α在多种肿瘤组织中表 达，肿瘤细胞通过高表达HIF-1α对其下游基因进 行调控以适应缺氧环境，促进肿瘤生长、侵袭、 转移等。因此，本研究应用靶向治疗药物吉非替 尼作用于缺氧条件下肺腺癌A549细胞，检测HIF- 1α蛋白与自噬表达水平的变化以及肿瘤细胞凋亡 率的变化，探讨HIF-1α及自噬表达与吉非替尼的 肺癌靶向治疗机制之间的关系。

本实验结果显示常氧或吉非替尼作用下HIF- 1α蛋白基本无表达。随后通过缺氧诱导模拟肿瘤 内低氧环境，发现缺氧24 h后A549细胞中HIF-1α 蛋白表达明显增加，证实了肺腺癌细胞为适应缺 氧导致HIF-1α蛋白表达上调。另外显示，吉非替 尼作用于缺氧的A549细胞，明显抑制HIF-1α蛋白 表达。Lu等^{[ 2 ]}在西妥昔单抗（抗EGFR的单克隆抗 体）介导的头颈部鳞癌放射增敏机制的研究中发 现，西妥昔单抗通过抑制辐射诱导的HIF-1α上调 而产生放射增敏作用。通过抑制缺氧诱导的HIF- 1α蛋白表达上调可能是吉非替尼抗肿瘤作用机制 之一，但还需进一步实验研究其信号通路的变化 从而探索其中机制。

本实验中，MAPLC3-Ⅱ蛋白检测及透射电子 显微镜观察结果均证实，吉非替尼或缺氧单独作 用均可诱导A549细胞自噬上调，而两者共同作用 时这种诱导自噬上调趋势更明显，表现出一种叠 加作用。Li等^{[ 3 ]}研究证实，西妥昔单抗通过下调 HIF-1α的表达来诱导肿瘤细胞的自噬表达。既往 研究证实PI3K/AKT/mTOR信号转导通路是自噬上 游控制信号，吉非替尼或缺氧条件可引起NSCLC 细胞系中自噬上游控制信号PI3K/AKT信号通路 激活，继而诱导肺癌细胞自噬上调。Rho等^{[ 4 ]}研究 证实可以通过调节HIF-1α的表达来避免缺氧环境 导致的吉非替尼耐药。雷帕霉素（一种自噬诱导 剂）已被证实可通过下调缺氧环境下NSCLC细胞 株的HIF-1α表达来诱导肿瘤细胞凋亡^{[ 5 ]}。但“HIF- 1α—自噬通路”与“EGFR-PI3K/AKT/mTOR通 路”之间通过何种方式交联目前还未明确。Larsen 等^{[ 6 ]}观察到在肿瘤组织中表达的EGFR和HIF-1α之 间呈正相关关系，在缺氧条件下，活化的EGFR通 过PI3K途径在翻译水平增加了HIF表达。下一步我 们将从PI3K/AKT/mTOR信号转导通路进行实验研 究，探索HIF-1α与EGFR之间的信号交联机制。

本实验还显示，吉非替尼作用于缺氧A549 细胞后，细胞凋亡率比吉非替尼或缺氧单独作用 时明显增加，提示吉非替尼既能诱导缺氧条件下 A549细胞自噬上调，也能促进低氧状态下A549 细胞凋亡。自噬和凋亡均对肿瘤细胞具有双重作 用。在肿瘤早期发生过程中，自噬主要抑制肿瘤 的形成，此时若自噬功能降低则会导致癌前病变 的发展，相反凋亡在早期可促进肿瘤的发生^{[ 7 ]}。由 于自噬过程和调控网络十分复杂，且自噬和凋亡 密切相关，在肿瘤中起着十分重要的作用。推测 在肿瘤治疗的不同时期，细胞自噬与凋亡之间可 能存在某种共同的调节因素和信号调控交汇点， 靶向治疗药物可分别或同时诱导自噬和凋亡，产 生抗肿瘤效果。

综上所述，吉非替尼能诱导缺氧的A549细胞 中自噬上调，并能抑制缺氧诱导的HIF-1α表达， 破坏了肺癌细胞适应缺氧的能力，使肺癌细胞凋 亡增加，从而可能促进肺癌的良性转归，HIF-1α 及自噬表达与吉非替尼的肺癌靶向治疗机制之 间可能存在相关性。但“HIF-1α—自噬通路”与 “EGFR-PI3K/AKT/mTOR通路”之间通过何种方 式交联目前还未明确，仍需要进一步研究证实。 深入研究自噬与凋亡间潜在的串流机制，寻找调 节自噬和凋亡平衡的分子开关，可为联合应用自 噬和凋亡来有效控制肿瘤的进展奠定基础。