肿瘤多药耐药（multiple drug resistance, MDR）是指由一种药物诱发，但同时又对其他 多种结构和作用机制迥异的抗癌药物产生交叉耐 药。MDR是肿瘤化疗失败的关键因素，寻找低 毒、有效的肿瘤耐药逆转剂是目前肿瘤治疗领域 研究的热点^{[ 1, 2 ]}。金龙胶囊（JLC）是以鲜守宫、 鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇三种动物药为原料经“低温 冷冻现代生化分离提取工艺”制成的抗癌中药复方 制剂，主要含有氨基酸、蛋白质、游离单糖、多 糖、小分子类物质等成分^{[ 3 ]}。多项临床研究显示， 金龙胶囊联合化疗治疗肝癌^{[ 4 ]}、肺癌^{[ 5 ]}、胃癌^{[ 6, 7 ]}、 胰腺癌^{[ 8 ]}、鼻咽癌^{[ 9 ]}、食管癌^{[ 10 ]}、大肠癌^{[ 11 ]}、乳腺 癌^{[ 12 ]}等，均有明显的减毒增效作用^{[ 13 ]}。本实验通 过建立体外不同耐药细胞模型，给予金龙胶囊干 预，考察不同浓度金龙胶囊对肿瘤多药耐药的可 能逆转作用和细胞增敏作用。 1 材料与方法 1.1 材料

金龙胶囊（JLC，北京建生药业有限公司，批 号120527-087），细胞培养液溶解，0.22 μM滤膜 过滤，现用现配；注射用硫酸长春新碱（VCR， 上海华联制药有限公司）；注射用盐酸阿霉素 （DOX，深圳万乐药业有限公司）；多西紫杉醇 （Paclitaxel，北京协和药厂馈赠，白色粉末，纯 度＞99%）；5-氟尿嘧啶（5-Fu，上海旭东海普药 业有限公司）；维拉帕米（VRP，Sigma，白色粉 末，纯度＞99%）。人肺腺癌耐紫杉醇耐药细胞 A549/Paclitaxel及其亲本细胞A549、人肝癌耐5-Fu 耐药细胞Bel7402/5-Fu及其亲本细胞Bel7402、人乳 腺癌耐紫杉醇耐药细胞MX-1/Paclitaxel及其亲本细 胞MX-1、人口腔上皮癌耐长春新碱细胞KB/V及其 亲本细胞KB均购自中国医学科学院药物研究所。 1.2 方法

人肺腺癌耐紫杉醇耐药细胞A549/Paclitaxel及 其亲本细胞A549、人肝癌耐5-Fu耐药细胞Bel7402/ 5-Fu及其亲本细胞Bel7402、人乳腺癌耐紫杉醇耐 药细胞MX-1/Paclitaxel及其亲本细胞MX-1、人口 腔上皮癌耐长春新碱细胞KB/V及其亲本细胞KB， 均培养于含10%新生牛血清的DMEM培养液内 （含青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml），37ºC、 5%CO2湿培养箱中培养，0.25%胰酶和0.02%EDTA 液消化传代。耐药株细胞A5 4 9 /Pa c l i t a x e l 、 Bel7402/5-Fu、MX-1/Paclitaxel、KB/V分别在含 20 nmol/L Paclitaxel、10 μg/ml 5-Fu、20 nmol/L Paclitaxel、200 nmol/L VCR的培养液中培养以维持 其耐药性，实验进行前细胞脱药一周。

采用MTT方法测定金龙胶囊对上述细胞的细 胞毒性及其肿瘤多药耐药逆转活性。取对数生长 期的敏感及耐药株肿瘤细胞胰酶消化，接种于96 孔细胞培养板中。24 h后，加入不同浓度的金龙胶 囊（取胶囊总填充物计算金龙胶囊浓度，胶囊总 填充物中辅料占比68.8%）和（或）抗肿瘤药物， 以VRP为阳性对照药，每个浓度设3个平行孔。 培养72 h，弃原培养液，每孔加入0.5 mg/ml MTT 液100 μl。继续培养4 h，弃去MTT液，每孔加入 DMSO 150 μl，混合振荡器振荡，于酶标仪570 nm 波长处测定吸收度（A）。上述实验重复三次。细 胞存活率（%）=100×A_给药组/A_对照组。利用Graphpad Prism6.0软件计算IC₅₀值。逆转倍数（RF，reversal fold）=IC₅₀（抗肿瘤药物）/IC₅₀（抗肿瘤药物+逆转剂）。实验重复 3~5次。 2 结果 2.1 金龙胶囊对四对肿瘤细胞生长的影响

金龙胶囊作用72 h，对所用到的四对肿瘤细胞 均具有弱的生长抑制作用，无明显细胞选择性， IC₅₀值在1.5~5.2 mg/ml水平。但不同细胞对金龙胶 囊的敏感度略有不同，因此在选择无毒浓度时不 同细胞的浓度略有差异。 2.2 金龙胶囊对A549/Paclitaxel及A549细胞的作用

金龙胶囊在100、200、400 μg/ml无毒浓度对 A549/Paclitaxel细胞对Paclitaxel的获得性耐药逆转 倍数分别为2.25、2.99和10.64，但活性弱于阳性 对照药VRP（VRP为P-gp抑制剂）。金龙胶囊对 A549/Paclitaxel细胞对VCR的交叉耐药无明显逆 转作用，见表 1。金龙胶囊及VRP在所用浓度下对 A549细胞无增敏作用，见表 2。

表 1(Table 1)

表 1 金龙胶囊对A549/Paclitaxel细胞耐药的逆转作用(n=3) Table 1 The effect of Jinlong Capsules on reversing MDR in A549/Paclitaxel cell line (n=3) Notes:-:no applicable; RF: reversal fold

表 1 金龙胶囊对A549/Paclitaxel细胞耐药的逆转作用(n=3) Table 1 The effect of Jinlong Capsules on reversing MDR in A549/Paclitaxel cell line (n=3)

表 2(Table 2)

表 2 金龙胶囊对A549细胞的敏感度影响(n=3) Table 2 The effect of Jinlong Capsules on A549 cell line (n=3) Notes:-:no applicable

表 2 金龙胶囊对A549细胞的敏感度影响(n=3) Table 2 The effect of Jinlong Capsules on A549 cell line (n=3)

金龙胶囊在50、100、200 μg/ml无毒浓度在 MX-1/Paclitaxel细胞对Paclitaxel的获得性耐药有弱 的逆转作用，对VCR的交叉耐药亦有一定的逆转 活性，但未显示量效关系。阳性对照药VRP显示 很好的逆转活性，见表 3。金龙胶囊在50、100、 200 μg/ml无毒浓度对MX-1细胞显示一定的增敏 作用，对Paclitaxel及VCR均表现出一定的量效关 系，见表 4。

表 3(Table 3)

表 3 金龙胶囊对MX-1/Paclitaxel细胞耐药的逆转作用(n=5) Table 3 The effect of Jinlong Capsules on reversing MDR in MX-1/Paclitaxel cell line (n=5) Notes: -:no applicable

表 3 金龙胶囊对MX-1/Paclitaxel细胞耐药的逆转作用(n=5) Table 3 The effect of Jinlong Capsules on reversing MDR in MX-1/Paclitaxel cell line (n=5)

表 4(Table 4)

表 4 金龙胶囊对MX-1细胞敏感度的影响（n=3~4） Table 4 The effect of Jinlong Capsules on MX-1 cell line (n=3-4) Notes: -:no applicable

表 4 金龙胶囊对MX-1细胞敏感度的影响（n=3~4） Table 4 The effect of Jinlong Capsules on MX-1 cell line (n=3-4)

KB/V细胞较KB细胞显示良好的耐药性， 对VCR及Paclitaxel的耐药因子分别约为321.5和 17215.9。金龙胶囊在100、200 、400 μg/ml无毒 浓度在KB/V细胞对VCR的获得性耐药仅在高剂量 表现弱的逆转活性，在KB/V细胞对Paclitaxel的交 叉耐药无明显逆转作用。阳性对照药VRP对KB/V 细胞的获得性耐药和交叉耐药均具极显著逆转活 性。金龙胶囊在200、400、800 μg/ml无毒浓度对 KB细胞无增敏作用。 2.5 金龙胶囊对Bel7402/5-Fu及Bel7402细胞的影响

Bel7402/5-Fu细胞的耐药机制与传统的P-gp高 表达相关性不大，5-Fu亦不是P-gp的底物，因此， 作为P-gp抑制剂的VRP对5-Fu无耐药逆转及增敏作 用。金龙胶囊在200、400、800 μg/ml无毒浓度对 Bel7402/5-Fu细胞对5-Fu的获得性耐药及对VCR的 交叉耐药均无逆转活性，见表 5。Bel7402细胞因 P-gp有表达存在内在耐药性，VRP对Bel7402细胞 对VCR的内在耐药具明显逆转活性（VCR为VRP 底物）。金龙胶囊在所用浓度下对Bel7402细胞对 5-Fu的作用无耐药逆转或增敏活性，但在高剂量 （200 μg/ml）时对VCR的作用具一定的耐药增敏 作用，见表 6。

表 5(Table 5)

表 5 金龙胶囊对Bel7402/5-Fu细胞耐药的逆转作用(n=3) Table 5 The effect of Jinlong Capsules on reversing MDR in Bel7402/5-Fu cell line (n=3) Notes:-:no applicable

表 5 金龙胶囊对Bel7402/5-Fu细胞耐药的逆转作用(n=3) Table 5 The effect of Jinlong Capsules on reversing MDR in Bel7402/5-Fu cell line (n=3)

表 6(Table 6)

表 6 金龙胶囊对Bel7402细胞敏感度的影响（n=3） Table 6 The effect of Jinlong Capsules on Bel7402 cell line (n=3) Notes:-:no applicable

表 6 金龙胶囊对Bel7402细胞敏感度的影响（n=3） Table 6 The effect of Jinlong Capsules on Bel7402 cell line (n=3)

肿瘤的化疗是当今治疗恶性肿瘤的主要手 段。然而，肿瘤细胞对药物的耐药性严重影响了 药物的临床疗效^{[ 14 ]}。据美国癌症协会估计，90% 以上的肿瘤患者死于不同程度的肿瘤细胞耐药， 因此逆转肿瘤细胞的耐药性、提高化疗药物的敏 感度对癌症的治疗具有积极意义。目前MDR化 学逆转剂临床效果欠佳，部分被用于逆转MDR 的化学药物因不良反应严重，使用范围受到极大 的限制。中药配合化疗使用有着很长的历史，临 床上往往显示出增效的作用，这或许与逆转MDR 有关。与化学药物逆转肿瘤MDR相比，中药具有 一定的优越性^{[ 15 ]}：(1)中药成分复杂，因此其逆转 MDR的作用往往不局限于某单一靶点，而是多靶 点综合作用；(2)中药不良反应小，引起的心血管 系统与免疫系统不良反应小，也较少引起抗肿瘤 药物代谢动力学的改变；(3)部分中药本身就具有 抗癌作用；(4)中药往往具有提高机体免疫功能、 抑制肿瘤细胞增殖与血管生成、诱导肿瘤细胞分化 与凋亡等多重功效。因此，在中药中筛选MDR逆 转剂具有很大的潜力。研究发现，汉防己甲素、榄 香烯、丹皮酚、人参皂苷、槲皮素、茶多酚、奎尼 定、苦参碱、姜黄素、川芎嗪、乌龙茶多酚等中药 成分均具有一定的逆转MDR作用^{[ 16, 17 ]}。然而这些研 究均以植物药居多，动物药尚未做过此方面的深入 研究。金龙胶囊是由三种动物药为原料制得的抗 肿瘤复方制剂，临床上的应用显示其联合化疗治 疗肿瘤具有增效的作用^{[ 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ]}。因此，本研究从细胞 生物学层面上来观察金龙胶囊对多种耐药细胞系 的耐药逆转作用，首次发现其对多种肿瘤耐药细 胞的耐药逆转作用，为其临床应用提供重要的实 验支持。同时，本研究也为寻找新型耐药逆转剂 以及拓展金龙胶囊在耐药逆转上的作用，奠定了 基础，为动物药的进一步开发提供科学依据，使 传统中药的精华得以继承发展。