肝癌（hepatocelluiar carcinoma,HCC）是全球 最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居消化系统第 三位，每年导致50万~100万人死亡^{[ 1 ]}。我国肝癌患 者占全世界的58.7%，在所有恶性肿瘤中，肝癌的 发病率和死亡率一直占据前列^{[ 2 ]}。临床研究数据表 明糖尿病可使肝癌的患病风险增加2~3倍^{[ 3, 4 ]}，但这 一机制因缺乏深入研究至今仍未明确。趋化因子 CCL5（RANTES）是一种可诱导的分泌型小分子 量炎症细胞因子，经病毒感染后的正常细胞和部 分肿瘤细胞均能分泌CCL5^{[ 5 ]}，近年来发现其与肿 瘤细胞的侵袭和转移有密切的关系，体内高表达 的CCL5可诱发恶性肿瘤^{[ 6, 7 ]}。本研究通过不同糖浓 度培养人肝癌细胞株HepG2和鼠源性肝癌细胞株 H22，检测高糖对细胞中CCL5mRNA表达的影响， 对比糖尿病小鼠和正常血糖小鼠的成瘤能力，并且 检测瘤组织中CCL5的表达，由此来验证CCL5在糖 尿病模型鼠致肝癌的发生、发展起重要作用。 1 材料和方法 1.1 材料

清洁级BALB/c小鼠60只，雄性，5周龄，体 质量（25±3）克，由南昌大学实验动物科学部提 供，动物合格证号: SYXK（赣）2010-0002。人 肝癌细胞株HepG2和小鼠肝癌细胞株H22均来自 南昌大学第二附属医院分子实验室；低糖DMEM 培养液[含葡萄糖(glucose,Glu)5.5 mmol/L]、高糖 DMEM培养液（含Glu25 mmol/L）、10%胎牛血 清购自北京Gibco公司；RNA提取试剂盒购自美国 OMEGA公司；反转录试剂盒由广州复能公司提 供；PCRmix试剂盒购自上海近岸生物公司；PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。链脲佐菌素 （STZ）购由美国Sigma公司，稳步血糖仪及试纸 由美国强生公司提供；鼠源性CCL5免疫组织化学 抗体购自美国Abcam公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞划痕实验

取长势良好的HepG2细胞，将计数调整至1×10⁵/ml。 将细胞接种到含有低糖培养液（含Glu 5.5 mmol/L）、中 糖培养液（含Glu 15 mmol/L ）、高糖培养液（含Glu 25 mmol/L ）的六孔板中，待细胞贴壁后取10 μl无菌枪头 在六孔板中分别划线，PBS清洗两遍，加入培养液后继 续培养48 h观察细胞的迁移能力。 1.2.2 不同糖浓度培养HepG2细胞检测CCL5 mRNA表达

低糖、高糖培养人肝癌HepG2细胞2周，离心 获得细胞。根据RNA提取试剂盒说明书分别提取 总RNA，紫外分光光度仪下测A值A260/A280大于1.8， 证明提取到的总RNA纯度符合实验要求。各样品采 用反转录试剂盒进行反转录cDNA合成。PCR扩增 CCL5基因，上游引物序列：5’-CGCTGTCATCCTC ATTGCTA-3’；下游引物序列：5’-GCACTTGCCAC TGGTGTAGA-3 ，目的片段长度148 bp 。以GAPDH 为内参基因，上游引物序列：5’-ACAGTCAGCCG CATCTTCTT-3’；下游引物序列：5’-GACAAGCT TCCCGTTCTCAC-3’，目的片段长度256 bp。采用 PCRmix试剂盒，取3 μlcDNA,加入PCR mix 25 μl、 上下游引物各1 μl、ddH2O 20 μl配制总体积至50 μl 体系。经94℃灭活90 s，30个循环，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳，软 件分析条带亮度。 1.2.3 不同糖浓度培养H22细胞检测CCL5 mRNA 表达

低糖、高糖培养小鼠肝癌H 2 2 细胞株2 周，离心获得细胞后提取总R N A ，反转录 cDNA,小鼠CCL5 基因引物序列: 上游引物： 5’-CCCTCACCATCATCCTCACT-3’；下游引物： 5’-CTTCTTCTCTGGGTTGGCAC-3’，目的片 段长度218 bp。小鼠看家基因SDHA上游引物： 5’-AGGTATCAATGCTGCTCTGG-3’；下游引物： 5’-AAGTAGGTTCGCCCGTAG-3’，目的片段长度 477 bp，PCR步骤同上一步。人肝癌细胞株HepG2 和鼠肝癌细胞株H22在低糖（含Glu 5.5 mmol/L） 和高糖（含Glu 25 mmol/L）培养2周后离心获得细 胞。产物扩增于2%琼脂糖凝胶电泳。 1.2.4 荷瘤小鼠的构建

BALB/c小鼠购进后自然光照，自由进水进 食。随机分为两组：A组为糖尿病模型鼠共30只； B组为正常对照组共30只。 A组喂养2周后通过链 脲佐菌素(STZ)腹腔小剂量多次注射构建糖尿病鼠 模型，注射前8 h禁食，正常进水。 STZ溶于柠檬 酸缓冲液（0.1 mol，pH4.5）配成的注射液，小鼠 称重后按80 mg/kg注射入腹腔，连续注射5 d；B组 一次性注入同样剂量的柠檬酸缓冲液，并喂以普 通饮食。腹腔注射后不同时间（3天、1周、2周） 点取A组鼠尾静脉血，经快速血糖仪检测，连续3 次测得空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出现多饮、多 食、多尿和体重减轻，即可确定糖尿病鼠模型构 建成功。测B组空腹血糖≤6.9 mmol/L，为正常普 通鼠。BALB/c小鼠肝癌模型造模方法：取长势良 好的鼠源性肝癌细胞株H22，经过离心收集细胞。 用4℃无血清培养液稀释细胞，并调整细胞计数至 2×10⁷，且尽量在30 min内用完保持细胞活性。小 鼠胸壁5~6肋间皮下注射各组细胞悬液0.2 ml。两 组小鼠模型种植肿瘤细胞株后，继续以正常饮食 喂养，每日观察成瘤情况，待模型成瘤15天后全 部灭杀。剖腹暴露，用游标卡尺测量各组成瘤体 积（V=ab²/2），切取肿块后并称重。10%中性福 尔马林液固定72 h，脱水、石蜡包埋。 1.2.5 瘤组织免疫组织化学检测CCL5表达

石蜡切片放入65℃烤箱30 min，常规脱蜡、水 化，PBS漂洗3次；抗原微波修复，PBS漂洗3次； 3%H₂O₂甲醛溶液覆盖10 min灭活内源性过氧化物 酶，PBS清洗3次，CCL5一抗4℃孵育12 h，PBS 漂洗3次；二抗37℃孵育30 min,PBS漂洗3次后使 用DAB显色，显微镜下观察后蒸馏水清洗终止染 色，苏木精对比染色细胞核，经分化、脱水、透 明、中性树脂封片。每张免疫组织化学切片显微 镜下放大400倍随机拍取8个视野，利用Image-pro plus 6.0软件进行图像分析，校正吸光度后软件自 动选取阳性的细胞标上颜色^{[ 8 ]}，并得出各组切片中 阳性细胞平均密度数据。 1.3 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行数据处理，两者 间均数比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 不同糖浓度HepG2细胞迁移能力

细胞铺板划线48 h后观察HepG2细胞株融合随 糖浓度的增加而加快，见图 1，且发现高糖培养液 颜色呈黄色，低糖培养液呈酚红色。

M:A:Cells were cultured with 5.5 mmol/L of Glu for 48 h;B:Cells were cultured with 15 mmol/L of Glu for 48 h;C:Cells were cultured with 25 mmol/L of Glu for 48 h 图 1 不同糖浓度培养HepG2细胞的迁移能力（SP×100） Figure 1 Migration of HepG2 cells cultured with different concentrations of glucose（SP×100）

高糖（含Glu 25 mmol/L ）培养人肝癌细胞株 HepG2的CCL5 mRNA条带亮度高于低糖（含Glu5.5 mmol/L）培养，见图 2A。高糖（含Glu 25 mmol/L ） 培养小鼠H22细胞的CCL5 mRNA条带亮度同样高 于低糖（含Glu 5.5 mmol/L）培养，见图 2B。

M:marker;1,3:internal references of CLL5;2:amplification products of CCL5 in cells cultured with high concentrations of glucose;4: amplification products of CCL5 in cells cultured with low concentrations of glucose A:murine H22 cells;B:HepG2 human hepatoma cells 图 2 小鼠H22细胞和HepG2人肝癌细胞CCL5 PCR电泳结果 Figure 2 PCR electrophoresis results of CCL5 in murine H22 cells and HepG2 human hepatoma cells

两组小鼠皮下注射H22细胞后，均可见明显的 肿瘤生成，糖尿病小鼠和正常小鼠的平均体质量 分别为（2.21±0.52）、（1.63±0.68）g(P＜0.05)， 肿瘤的平均体积分别为（3.4±0.42）、（2.18± 0.55）cm3（P＜0.05）。可见肿瘤已与皮肤充分 融合，并且出现坏死，切开皮肤可见肿瘤呈圆形 或椭圆形，瘤表面呈现结节状且与皮肤粘连，表 面毛细血管丰富，切面呈灰白色、鱼肉状，见大 量坏死，远处淋巴结未见转移。镜下观察成瘤组 织，可见瘤细胞大小较为均匀，细胞核大深染， 大小形态不规则，核染色不均匀，胞质少，偶见 病理性核分裂相，部分小淋巴细胞浸润，见图 3。 免疫组织化学显示CCL5在各组均有散在表达， IPP6.0分析吸光度数据，单因素方差分析（LSD 法），结果显示A组CCL5的表达高于B组，见图 3，两者间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

A:mass laminar necrosis with heterocysts and mitotic images(HE ×400);B:positive claybank staining in the cytoplasm in a scattered or flaked distribution（IHC×400);C:light yellow staining in the cytoplasm(IHC ×400) 图 3 CCL5在瘤组织中的HE染色和免疫组织化学染色结果 Figure 3 HE and immunohistochemical staining of the expression patterns of CCL5 in different tumor tissues

肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞与外基质之 间一系列复杂的多因素的相互过程。目前研究表 明，肝癌的预后和复发率与糖尿病有密切的关 系，糖尿病合并肝癌患者手术切除后复发率和死 亡率显著高于非糖尿病患者^{[ 8, 9 ]}。糖尿病可增加肝 癌的患病风险并加快肿瘤生长转移，其中的机制 非常复杂，大量的文献报道了体内高糖可刺激细 胞DNA损伤，导致细胞变异诱发肿瘤^{[ 10, 11 ]}。正常 的血糖可通过有氧和无氧代谢为机体提供能量， 而高浓度的血糖可在肿瘤细胞内进行无氧酵解， 为肿瘤细胞提供能量来源。我们在细胞培养过程 中发现，高糖培养人肝癌细胞株HepG2中培养液 呈黄色，而低糖培养为酚红色，这表明高糖培养 的HepG2细胞代谢能力强，释放含酸物种增多， 耗尽培养液中的营养物种。于是，我们设想高糖 是否刺激了某种因子使肿瘤细胞生长旺盛，导致 了糖尿病患肝癌的发生增加。

我们利用Gene Sifter在线软件和BRB- Array Tools 对公共基因芯片数据库GEO(Gene Expression Omnibus)分析肝癌病人瘤细胞的基因 芯片表达数据的统计学差异，发现趋化因子CCL5 （RANTES）可能在糖尿病诱发肝癌起重要作 用。实验数据也表明体外高糖培养肿瘤细胞中的 CCL5含量显著高于低糖培养，说明高血糖可使 肿瘤细胞中的CCL5含量增高，而体内高表达的 CCL5可通过聚集和活化肿瘤细胞中基质金属蛋 白酶（matrix metalloproteinase,MMP），特别是 MMP中的MMP9，可以促进肿瘤血管的生成和生 物活性，从而加快肿瘤的生长于转移^{[ 7 ]}。最近有研 究还发现CCL5可被肿瘤细胞或炎症细胞分泌到肿 瘤组织中，在体内的恶性肿瘤的发展、浸润中扮 演重要角色，同时参与肿瘤组织内血管的生成^{[ 6 ]}。

本实验通过不同糖浓度培养人肝癌细胞株 HepG2证实了高糖可使细胞的迁移能力增强，且 高糖培养可使细胞内CCL5呈现较高表达，动物实 验也表明糖尿病BALB/c小鼠更易于肝癌的生长， 检测糖尿病鼠瘤组织中CCL5含量高于正常血糖 鼠，较高表达的CCL5会对肿瘤的生长、转移发挥 促进作用，从而为CCL5为糖尿病促进肝癌细胞的 生长、转移奠定实验基础。由于BALB/c小鼠基因 组与人类同源性达90%以上，小鼠肿瘤在组织形 态、临床过程方面都与人类肿瘤有着相似之处^{[ 12 ]}。 因此，本实验将为研究人体糖尿病诱发肝癌发生 提供可靠的理论依据。因实验组未能收集到足够 的糖尿病合并肝癌患者的组织标本，所以没有进 行肿瘤组织内的CCL5检测。下一步，我们将对比 糖尿病合并肝癌患者肿瘤组织与单纯患肝癌瘤组 织内的CCL5表达的差异，进一步证明趋化因子 CCL5在糖尿病合并肝癌患者中发挥重要作用，为 糖尿病合并肝癌的防治提供新思路。