结肠肿瘤严重危害人类健康。因此，对于结 肠肿瘤发生、发展机制的探索，一直是生命科学 领域研究的焦点。目前这方面的研究主要集中在 肿瘤相关基因的克隆和功能分析、细胞信号转导 通路及细胞周期调控三大领域。近年来，Wnt信号 通路不仅是发育生物学，同时也是肿瘤生物学的 研究热点。本实验就Wnt/PCP信号通路在大鼠结肠 癌形成过程中的作用进行了初步的研究。 1 材料与方法 1.1 实验动物

健康4~6周龄雄性SD大鼠60只，体质量150~180 g。 由徐州医学院实验动物中心提供。实验过程严格 遵守国际伦理指南和我国涉及实验动物福利、管 理和使用的条例和立法，并通过徐州医学院实验 动物伦理委员会审查。 1.2 主要试剂

N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)为美国Sigma公司 产品；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR 试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；引物由 上海 生工生物工程技术服务有限公司设计合成。 1.3 MNU灌肠诱导大鼠结肠肿瘤

先将MNU用二甲基亚砜配成4 mg/ml溶液。灌 药前禁食减少粪便干扰。灌肠前先让大鼠吸入适 量乙醚，减少大鼠躁动。将水润滑细导尿管剪成 10 cm长，与注射器相连，经肛门插入结肠，插入 深度约为6~8 cm，灌注剂量为20 mg/kg，灌肠持续 时间1 h后抽出灌肠液，待大鼠清醒后恢复正常饮 食和活动。开始时以3次/周连续灌注4周，之后持续 以1次/周灌注，于灌药后12周和16周分两批处死大鼠，对于可疑结肠肿瘤，取部分组织以10%中性福 尔马林固定备病理分析用，部分组织保存在-80℃ 冰箱中以备RT-PCR分析用，距可疑肿瘤组织至少5 cm外取正常结肠组织备用。 1.4 实验分组

将灌肠诱导所得23例结肠癌组织作为结肠癌 组；将诱导所得28例结肠非典型增生组织随机剔 除5例后作为非典型增生组；解剖过程中所取正常 结肠组织随机抽取23例作为对照组。 1.5 RT-PCR检测Wnt7a、JNK和RhoA在各组织中的转录

用TRIzol提取液提取组织中的总RNA，按反转 录试剂盒的操作步骤反转录成cDNA，再按照PCR 试剂盒的操作步骤进行扩增，引物由上海生工设 计合成，见表 1。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，紫 外灯箱观察拍照后用ImageJ软件进行分析。

表 1(Table 1)

表 1 RT-PCR引物序列、退火温度及产物大小 Table 1 RT-PCR primers sequences, annealing temperature and product sizes

表 1 RT-PCR引物序列、退火温度及产物大小 Table 1 RT-PCR primers sequences, annealing temperature and product sizes

半定量RT-PCR电泳条带灰度值用ImageJ软件 分析获得。所有的计量资料均采用均数±标准（x±s）表示。组间数据比较采用单因素方差分析，以 P＜0.05表示差异有统计学意义。统计结果的图形 由SPSS16.0统计软件绘制输出。 2 结果 2.1 大鼠结肠组织病理结果

于灌药12周和16周分批处死并收集可疑肿瘤组 织，见图 1A。分析各个实验组病理切片，肿瘤的 变化呈现非典型增生-腺癌的变化过程。病理证实 MNU灌肠法可以成功诱导SD大鼠结肠肿瘤的形 成，见图 1B、1C。具体病理分型及数量见表 2。

A:gross appearance; B: colon atypical hyperplasia tissue(HE ×100); C: colorectal tissue (HE ×200) 图 1 MNU诱导所得大鼠结肠肿瘤组织 Figure 1 MNU-induced rats colon tumor tissues

表 2(Table 2)

表 2 MNU诱导结肠肿瘤病理分析结果 Table 2 Pathologic analysis of MNU-induced colon tumor

表 2 MNU诱导结肠肿瘤病理分析结果 Table 2 Pathologic analysis of MNU-induced colon tumor

用半定量RT-PCR检测，Wnt/PCP信号通路中重 要因子在结肠癌组织、结肠非典型增生组织和正常 结肠组织中的表达情况，见图 2。其数据统计见表 3。

A: Wnt7a; B: RhoA; C; JNK; D: gray value histogram 图 2 RT-PCR检测Wnt7a、JNK和RhoA的表达 Figure 2 Expression of Wnt7a, JNK and RhoA detected by RT-PCR

表 3(Table 3)

表 3 半定量RT-PCR电泳条带分析方法检测Wnt7a、JNK和RhoA在不同组织中的灰度值(x±s) Table 3 Semi-quantitative RT-PCR electrophoretic band analysis of grey value of Wnt7a, JNK and RhoA in different tissues(x±s)

表 3 半定量RT-PCR电泳条带分析方法检测Wnt7a、JNK和RhoA在不同组织中的灰度值(x±s) Table 3 Semi-quantitative RT-PCR electrophoretic band analysis of grey value of Wnt7a, JNK and RhoA in different tissues(x±s)

目前有多种结肠癌动物模型构建方法^[1]，但 是有些模型也存在部分缺陷，理想的动物模型应 该是自然模拟结肠癌的发生发展过程。MNU经直 肠灌注方式进入大鼠体内，其不依赖于体内酶代 谢和肠道菌群转化，可直接作用于局部肠上皮， 引起细胞癌变诱发结肠癌。与间接致癌物诱发的 实验性结肠癌比较，MNU诱癌大肠癌具有方法简 易、诱癌潜伏期短等特点^[2]。

本实验成功地通过MNU灌肠方法建立了SD大 鼠结肠癌模型，成瘤时间相对较短，成瘤率高， 肿瘤组织病理比较稳定，模拟了结肠癌自然发生 的过程，应用SD大鼠提升了进一步实验操作的空 间，为更深入地研究结肠癌发病机制、转移机制 及治疗研究提供了一种理想的动物模型。

Wnt基因最初由Nusse和Varmus于1982年发 现^[3]，Wnt信号通路是由Wnt信号蛋白及其跨膜受 体、胞质信号转导蛋白、调节因子、核内转录因子等共同组成的复杂信号转导通路。根据Wnt 信 号蛋白传递方式不同，Wnt 信号通路分为三条途 径：（1）经典 Wnt 信号途径：即Wnt/β-catenin 信 号途径。其在胚胎发育和肿瘤中的作用已基本阐 明。因此，Wnt/β-catenin 信号通路被公认为新的 抗癌治疗的分子靶点^[4]；（2）Wnt/Ca2+途径：该 通路调节细胞运动和黏着性，同时能拮抗经典Wnt 信号通路,发挥抑癌作用^[5]；（3）平面细胞极性途 径：在脊椎动物中又称Wnt/JNK途径，在胚胎发育 阶段调控细胞骨架的重排，并参与原肠胚形成， 但迄今为止尚无此途径涉及肿瘤事件的报道^{[6, 7]}。 随着研究的不断深入，Wnt通路在肿瘤中异常活化 的机制主要涉及通路中各组成成员的异常表达， 以及该通路拮抗物的失活。

我们的实验结果表明，在mRNA水平， Wnt7a、JNK和RhoA在结肠非典型增生组织及结 肠癌组织中的表达均高于在正常结肠组织中的 表达，经单因素方差分析，差异有统计学意义 （P<0.05），而在结肠非典型增生组织和结肠癌 组织中的表达却无明显差异。这表明Wnt/PCP信号 通路在大鼠结肠癌形成过程中可能起到非常重要的作用，可能成为肿瘤靶向治疗的靶点。