2.系统生物医学教育部重点实验室
2.Key Laboratory of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, Ministry of Education
胃癌的发生是一个多步骤、多因素进行性发 展的过程。甲基化状态的改变是引起肿瘤发生发展的一个重要因素,表现为肿瘤细胞基因组DNA 整体甲基化水平降低和CpG岛等局部甲基化水平 的异常升高,异常甲基化通过影响基因转录、促 进原癌基因的表达和抑癌基因的不表达、增加染 色体结构的不稳定性等多方面促进胃癌的发生发 展。DNA甲基化主要发生在肿瘤抑制基因启动子区 CpG岛。启动子区CpG 岛甲基化抑制启动子功能使 肿瘤抑癌基因表达沉默,从而导致肿瘤发生[1]。甲 基化的研究,为肿瘤的早期预测、分类、分级、 预后评估及治疗方法提供新的依据[2]。
SHP1基因是一个主要来源于造血细胞的抑癌 基因,可以特异地下调细胞内跨膜受体信号[3]。 SHP1启动子区甲基化导致SHP1蛋白表达的减少和 缺失被认为是白血病[4]、淋巴瘤[5]等肿瘤细胞的典 型特征。SHP1基因作为一个靶向基因有可能为肿 瘤的治疗提供一条新途径,在疾病的发生和预后 的判断具有重要意义[6]。目前国内尚缺乏对胃癌 细胞中SHP1基因甲基化分析的报道,本实验围绕 SHP1基因启动子区甲基化状态开展研究。
本研究中建立了一种无需提取DNA,可直接 用少量细胞(1×103个细胞)进行基于重亚硫酸盐 修饰的甲基化特异性PCR(MSP)方法,并将其应 用于少量胃癌细胞MKN45和MKN28的SHP1基因 启动子区域甲基化的研究。CpG岛甲基化是胃癌的 重要致病机制,抑癌基因SHP1的甲基化状态检测 为丰富胃癌DNA的甲基化谱式提供了实验数据, 深入研究有望为胃癌的早期诊断提供新的思路。 1 材料与方法 1.1 材料
人胃癌细胞株MKN45、MKN28为上海瑞金医 院消化科刘炳亚研究员提供。对照组白血病细胞 株K562由本院陈竺院士实验室提供。 胎牛血清和RPMI 1640培养液购自美国Gibco 公司;DNA甲基化修饰试剂和DNA聚合酶购自美 国ZYMO公司; Ex-Taq聚合酶和T载体购自日本 TaKaRa公司;甲基化与非甲基化特异性PCR引物 (M-MSP/ U-MSP)由英潍捷基(上海)贸易有限 公司(Life technologies TM)合成。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养
胃癌细胞株MKN45、MKN28贴壁生长,对照 组白血病细胞K562半贴壁生长。以5×106/L的密度 接种于含10%新生胎牛血清的RPMI 1640培养液, 加入青霉素100 u/ml的培养体系中,在37℃、体积 分数5% CO2、相对饱和湿度90%的培养箱中传代 培养。待细胞生长状态良好且有80%融合时进行传 代,2~3天传代一次,培养5~7天。收获细胞,用 于检测SHP1基因的甲基化状态。 1.2.2 SHP1基因转录起始位点CpG岛分析及MSP引物设计
从NCBI数据库中检索选取SHP1基因 (Locus tag:AT3G58780,GenBank accession no. X82818)转录起始位点上游1 000 bp至第一 个外显子区,共2 340 bp的核苷酸序列作为分析 对象。利用甲基化分析软件Cpgplot、MethPrimer V1.1 beta结合Methyl Primer Express software V1.0 预测被分析序列内的CpG岛,同时设计甲基化特 异性PCR(MSP)引物[7, 8],并将设计好的甲基化 (M-MSP)和非甲基化(U-MSP)特异性引物通过 Blast进一步验证,确保目标扩增序列的特异性[9]。 1.2.3 细胞基因组DNA亚硫酸盐(Bisulfite)修饰
按照DNA甲基化修饰试剂盒说明书制备CT Conversion Reagent和M-Wash Buffer。注意CT Conversion Reagent应现用现配,避光保存。收集 研究组胃癌细胞株MKN45和MKN28、对照组白 血病细胞株K562各1×103个细胞直接进行蛋白酶 K消化(无需提取DNA)、130 μl CT Conversion Reagent进行Bisulfite修饰、柱内600 μl M-binding Buff er及100 μl M-Wash Buff er脱盐纯化、200 μl M-Desulphonation脱磺基、10 μl M-Elution Buffer洗脱 修饰后的DNA进行MSP检测或−20℃避光保存备用。 1.2.4 MSP检测SHP1基因甲基化状态
甲基化PCR引物设计软件MethPrimer设计的 两对引物M-MSP、U-MSP均用于经Bisulfite修饰 后的DNA模板扩增,其中引物M-MSP用于扩增甲 基化DNA,引物U-MSP用于扩增未甲基化DNA, 引物相关数据见表 1。MSP反应体系25 μl,其中 Bisulfite修饰后基因组DNA模板4 μl,10×缓冲液 2.5 μl,上游和下游引物(5 μM)各1 μl ,dNTP 各 Mix(2.5 μM)2 μl、MgCl2(25 mM)3 μl、Taq™ DNA (1U)0.5 μl,去离子水11 μl。扩增循环条 件:95℃ 预变性10 min后,94℃变性30 s,58℃退 火30 s,72℃延伸7 min,扩增38个循环,72℃延 伸5 min。MSP产物经2%琼脂糖凝胶电泳,GelRed 染色,用紫外检测仪Tanon 3500凝胶图像分析系统 观察检测结果。 1.2.5 克隆、测序质检SHP1基因序列
用胶回收试剂盒(AxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit)回收并纯化MSP产物159 bp目的片 段,克隆至pMD19-T载体,在10 μl体系(含Solution I 5μl,pMD19-T 1 μl,MSP回收产物4 μl)中于16℃ 下连接16 h,转化感受态DH5α,冰浴30 min后 42℃热激90 s,加入不含抗生素的(SOC)培养液 37℃复苏40 min。取复苏后菌液100 μl涂布于LB/ 氨苄青霉素平板,涂布均匀后放入37℃培养箱中 培养过夜。挑取6个白色单克隆菌落做PCR扩增验 证,同时挑取一个蓝色菌落做为对照。经菌落PCR 及电泳鉴定后,阳性克隆为单一条带,产物大小符 合,PCR产物委托英潍捷基(上海)贸易有限公司(Life technologies TM)进行Sanger测序。 1.2.6 分析SHP1基因序列及启动子区域CpG位点
应用甲基化分析软件对亚硫酸盐修饰后胃 癌细胞SHP1基因启动子区域测序数据进行序列 分析:BLAST结合Chromas软件分析测序峰图, QUMA(http://quma.cdb.riken.jp/)在线软件比较 Bisulfite修饰前后序列变化并分析CpG位点甲基化 状态。 1.3 结果判定标准
甲基化特异性引物扩增(M-MSP)呈阳性条 带,非甲基化特异性引物扩增(U-MSP)呈阴性 条带提示该样本基因启动子区呈高甲基化状态; 如U-MSP呈阳性条带,而M-MSP呈阴性条带,则 提示该基因启动子区呈非甲基化状态;如两者均 出现阳性条带者为部分甲基化,亦判定为该基因 启动子呈甲基化状态。对MSP产物进行克隆测序 进一步判断CpG位点是否发生甲基化:M-MSP阳 性条带者,测序示CpG二核苷酸中的碱基C被亚硫 酸氢钠修饰后仍旧为C,则证实该位点为甲基化状 态;U-MSP阳性条带者,测序示CpG岛CpG二核苷 酸中的碱基C被亚硫酸氢钠修饰再经PCR扩增后变 为T,则证实该位点为非甲基化状态。 2 结果 2.1 SHP1基因转录起始位点CpG岛分析及MSP引物设计
用Cpgplot软件及MethPrimer v1.1 beta分析CpG 岛结果显示:GC含量>50%、CpG含量与期望含量 之比(observed/expected,Obs/Exp)>0.60、CpG 岛长度>200 bp,表明CpG双核苷酸相对聚集,见 图 1。MethPrimer软件引物设计及Blast验证MSP 引物结果表明:甲基化(M-MSP)和非甲基化 (U-MSP)两对引物均位于SHP1基因第一外显子 区近转录起始位点,MSP引物含有9个CpG位点, 严谨度很高,扩增序列特异性强,采用55℃~62℃ 梯度摸索最佳条件为58℃,见表 1。
Criteria: GC percent > 50.0, Obs / Exp > 0.60, island size > 200m |
利用BLAST(basic local alignment search tool,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分析经Bisulfite修 饰后的胃癌细胞SHP1启动子区域Sanger测序数据, 同时结合Chromas软件对测序峰图进行分析,序列 比对结果正确,表明测序正确。使用甲基化测序结 果分析软件QUMA(http://quma.cdb.riken.jp/)将 Bisulfite修饰前后的SHP1启动子区序列整齐排列, 并比较非甲基化C→U→T转化及CpG甲基化位点, 结果显示SHP1基因启动子区域的DNA序列中含有 大量的CpG岛,且CpG岛非甲基化DNA经Bisulfite 修饰后C变为U,经PCR扩增变成T,说明胃癌细胞 中SHP1基因确实存在甲基化状态,见图 2。
M-MSP引物扩增产物阳性条带159 bp者表明 存在DNA甲基化,应用U-MSP引物出现扩增产物 阴性条带161 bp者即为不存在DNA甲基化,若同时 出现扩增产物则考虑存在部分DNA甲基化。结果 表明对照组K562细胞SHP1基因M-MSP引物扩增呈 现条带,表现为高甲基化,与文献报道结果一致[3]。 胃癌细胞MKN45和MKN28中SHP1基因启动子区 CpG岛M-MSP引物都出现扩增条带,而U-MSP引物无扩增条带,表现为高甲基化(仅出现甲基化 条带),见图 3。
Marker: DL2000 DNA marker;M: PCR product with specific PCR primes for methylated DNA;U: PCR product with specific PCR primes for unmethylated DNA;K562: control group |
胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,近年来 胃癌发病率及死亡率居高不下,且年轻化速度越 来越快,主要原因是人们对胃癌的发病机制尚未 彻底了解,缺乏有效的早期诊断及防治措施。因 此,揭示胃癌的发生发展机制,对其进行有效的 早期预警、早期诊断、早期防治显得尤为重要。 抑癌基因DNA的异常甲基化是肿瘤发生发展的一 条重要途径,当肿瘤抑制基因发生高甲基化,可 造成相关基因表达沉默,出现细胞以缺失或突变 的方式恶性生长。研究表明DNA甲基化发生在细 胞恶变之前,因此检测DNA启动子区是否发生了 高甲基化有助于早期发现突变细胞[10]。
SHP1基因定位于12p13,由含有17个外显子 并含有2.4~2.6 Kb转录长度的横跨大约17 Kb的 DNA组成。含有SH2的SHP1基因主要表达于造 血细胞,在生长因子受介导的信号转导过程中具 有重要的负性调控作用,是造血细胞恶性肿瘤的 抑癌基因[11]。SHP1能调控JAK发生去磷酸化而阻 断JAK/STAT信号通路,其功能丢失使JAK激酶活 性增高,并导致细胞的过度增殖[12]。研究表明, SHP1在白血病[4]、淋巴瘤[5]、多发性骨髓瘤[10,13]、 结肠癌[14]等肿瘤组织中表达失活主要是由于其启 动子区CpG岛的特异性高甲基化所致。SHP1基因 作为淋巴瘤、白血病等肿瘤的分子诊断标志及治 疗新靶点已经引起了人们的广泛关注[6]。目前,国 内尚缺乏对胃癌细胞中SHP1基因启动子分析的报 道,本实验结果显示,SHP1基因转录起始点附近 序列富含CpG二核苷酸,形成9个CpG位点,存在 高甲基化的条件。
MSP法是一种快速、实用的基因甲基化检测 方法,敏感度高,特异性强[15],定量分析SHP1基 因启动子区CpG岛甲基化水平,可以更好地揭示 SHP1启动子区CpG岛所包含的表观遗传学信息, 明确DNA甲基化模式在SHP1基因差异表达机制中 的作用[16]。本实验通过建立一种无需提取DNA、 可直接用少量细胞进行甲基化检测的、基于 Bisulfite修饰的MSP方法,并用此方法研究了胃癌 细胞中SHP1基因启动子区域CpG岛甲基化状态。结果显示,胃癌细胞MKN45和MKN28中SHP1基 因启动子区CpG岛甲基化特异性引物出现扩增条 带,而非甲基化特异性引物无扩增条带,表现为 高甲基化。测序结果显示在SHP1基因启动子区域 的DNA序列中含有大量的CpG岛,所检测的DNA 序列跨越了SHP1基因的转录起始位点,表明胃癌 细胞中SHP1基因启动子区CpG岛存在DNA的高甲 基化,提示SHP1基因启动子区域的DNA甲基化状 态与SHP1基因的表达之间存在较为密切的联系。 以上实验结果初步显示与大多数抑癌基因如P16、 MGMT、THBS1、Runx3、CDH1、RASGRF1等相 似[17, 18, 19] ,抑癌基因的表达水平和其启动子区域的 DNA甲基化水平呈负相关,进一步证实了基因启 动子区高甲基化可导致该基因表达缺失,甲基化 修饰可能是导致胃癌SHP1基因失活的机制之一。
对某一特定肿瘤建立一个涉及多个肿瘤相关 基因的 DNA甲基化谱式,有利于肿瘤的早期诊断 或鉴别诊断[20]。SHP1基因启动子区域甲基化的研 究也为丰富胃癌 DNA的甲基化谱式提供了实验数 据。研究结果表明,胃癌细胞中存在SHP1基因启 动子CpG岛高甲基化,通过对SHP1基因进一步深 入研究,有助于阐明SHP1启动子CpG岛甲基化与 胃癌发生发展的关系,为胃癌的早期筛查及靶向 生物治疗提供科学依据。
[1] | Sandoval J, Heyn H, Moran S, et al. Validation of a DNA methylation microarray for 450,000 CpG sites in the human genome[J]. Epigenetics,2011,6(6):692-702. |
[2] | Esteller M. CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future[J].Oncogene,2002,21 (35):5427-40. |
[3] | Oka T, Ouchida M, Koyama M, et al. Gene silencing of the tyrosine phosphatase SHP1 gene by aberrant methylation in leukemias/lymphomas[J].Cancer Res,2002,62(22):6390-4. |
[4] | Kumagai C, Kalman B, Middleton FA, et al. Increased promoter methylation of the immune regulatory gene SHP-1 in leukocytes of multiple sclerosis subjects[J].J Neuroimmunol,2012,246(1-2): 51-7. |
[5] | Capello D,Gloghini A,Baldanzi G,et al.Alterations of negative regulators of cytokine signalling in immunodeficiency-related non-Hodgkin lymphoma[J]. Hematol Oncol,2013,31(1):22-8. |
[6] | Khan H,Vale C, Bhagat T, et al. Role of DNA methylation in the pathogenesis and treatment of myelodysplastic syndromes[J]. Semin Hematol,2013,50(1):16-37. |
[7] | Li LC, Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs[J]. Bioinformatics,2002,18(11): 1427-31. |
[8] | Bock C, Reither S, Mikeska T, et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing[J]. Bioinformatics, 2005,21(21):4067-8. |
[9] | Barekati Z, Radpour R, Kohler C,et al. Specificity of methylation assays in cancer research: a guideline for designing primers and probes[J].Obstet Gynecol Int,2010,2010. |
[10] | Braggio E, Maiolino A, Gouveia ME,et al. Methylation status of nine tumor suppressor genes in multiple myeloma[J]. Int J Hematol, 2010,91(1):87-96. |
[11] | Wu C, Sun M, Liu L,et al.The function of the protein tyrosine phosphatase SHP-1 in cancer[J]. Gene,2003,306:1-12. |
[12] | Minoo P, Zadeh MM, Rottapel R, et al. A novel SHP-1/Grb2-dependent mechanism of negative regulation of cytokine-receptor signaling: contribution of SHP-1 C-terminal tyrosines in cytokine signaling[J]. Blood,2004,103(4):1398-407. |
[13] | Chim CS, Fung TK, Cheung WC, et al. SOCS1 and SHP1 hypermethylation in multiple myeloma: implications for epigenetic activation of the Jak/STAT pathway[J]. Blood, 2004,103(12):4630-5. |
[14] | Xu SB, Liu XH, Li BH, et al.DNA methylation regulates constitutive expression of Stat6 regulatory genes SOCS-1 and SHP-1 in colon cancer cells[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2009,135(12):1791-8. |
[15] | Ku JL, Jeon YK, Park JG. Methylation-specific PCR[J]. Methods Mol Biol,2011,791:23-32. |
[16] | Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1996,93(18):9821-6. |
[17] | Min SY, Kim HS, Jung EJ, et al. Prognostic significance of glutathione peroxidase 1 (GPX1) down-regulation and correlation with aberrant promoter methylation in human gastric cancer[J]. Anticancer Res, 2012,32(8):3169-75. |
[18] | Ye T, Chen Y, Fang J. DNA methylation biomarkers in ser um f or gastr ic cancer scr eening[ J] . Mini Rev Med Chem,2010,10(11):1034-8. |
[19] | Takamaru H, Yamamoto E, Suzuki H, et al. Aberrant methylation of RASGRF1 is associated with an epigenetic field defect and increased risk of gastric cancer[J].Cancer Prev Res(Phila), 2012,5(10):1203-12. |
[20] | To KF, Leung WK, Lee TL, et al. Promoter hypermethylation of tumor-related genes in gastric intestinal metaplasia of patients with and without gastric cancer[J]. Int J Cancer, 2002,102(6):623-8. |