胃癌的发生是一个多步骤、多因素进行性发 展的过程。甲基化状态的改变是引起肿瘤发生发展的一个重要因素，表现为肿瘤细胞基因组DNA 整体甲基化水平降低和CpG岛等局部甲基化水平 的异常升高，异常甲基化通过影响基因转录、促 进原癌基因的表达和抑癌基因的不表达、增加染 色体结构的不稳定性等多方面促进胃癌的发生发 展。DNA甲基化主要发生在肿瘤抑制基因启动子区 CpG岛。启动子区CpG 岛甲基化抑制启动子功能使 肿瘤抑癌基因表达沉默，从而导致肿瘤发生^[1]。甲 基化的研究，为肿瘤的早期预测、分类、分级、 预后评估及治疗方法提供新的依据^[2]。

SHP1基因是一个主要来源于造血细胞的抑癌 基因，可以特异地下调细胞内跨膜受体信号^[3]。 SHP1启动子区甲基化导致SHP1蛋白表达的减少和 缺失被认为是白血病^[4]、淋巴瘤^[5]等肿瘤细胞的典 型特征。SHP1基因作为一个靶向基因有可能为肿 瘤的治疗提供一条新途径，在疾病的发生和预后 的判断具有重要意义^[6]。目前国内尚缺乏对胃癌 细胞中SHP1基因甲基化分析的报道，本实验围绕 SHP1基因启动子区甲基化状态开展研究。

本研究中建立了一种无需提取DNA，可直接 用少量细胞（1×10³个细胞）进行基于重亚硫酸盐 修饰的甲基化特异性PCR（MSP）方法，并将其应 用于少量胃癌细胞MKN45和MKN28的SHP1基因 启动子区域甲基化的研究。CpG岛甲基化是胃癌的 重要致病机制，抑癌基因SHP1的甲基化状态检测 为丰富胃癌DNA的甲基化谱式提供了实验数据， 深入研究有望为胃癌的早期诊断提供新的思路。 1 材料与方法 1.1 材料

人胃癌细胞株MKN45、MKN28为上海瑞金医 院消化科刘炳亚研究员提供。对照组白血病细胞 株K562由本院陈竺院士实验室提供。 胎牛血清和RPMI 1640培养液购自美国Gibco 公司；DNA甲基化修饰试剂和DNA聚合酶购自美 国ZYMO公司； Ex-Taq聚合酶和T载体购自日本 TaKaRa公司；甲基化与非甲基化特异性PCR引物 （M-MSP/ U-MSP）由英潍捷基（上海）贸易有限 公司（Life technologies TM）合成。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养

胃癌细胞株MKN45、MKN28贴壁生长，对照 组白血病细胞K562半贴壁生长。以5×10⁶/L的密度 接种于含10%新生胎牛血清的RPMI 1640培养液， 加入青霉素100 u/ml的培养体系中，在37℃、体积 分数5% CO₂、相对饱和湿度90%的培养箱中传代 培养。待细胞生长状态良好且有80%融合时进行传 代，2~3天传代一次，培养5~7天。收获细胞，用 于检测SHP1基因的甲基化状态。 1.2.2 SHP1基因转录起始位点CpG岛分析及MSP引物设计

从NCBI数据库中检索选取SHP1基因 （Locus tag：AT3G58780，GenBank accession no. X82818）转录起始位点上游1 000 bp至第一 个外显子区，共2 340 bp的核苷酸序列作为分析 对象。利用甲基化分析软件Cpgplot、MethPrimer V1.1 beta结合Methyl Primer Express software V1.0 预测被分析序列内的CpG岛，同时设计甲基化特 异性PCR（MSP）引物^{[7, 8]}，并将设计好的甲基化 （M-MSP）和非甲基化（U-MSP）特异性引物通过 Blast进一步验证，确保目标扩增序列的特异性^[9]。 1.2.3 细胞基因组DNA亚硫酸盐（Bisulfite）修饰

按照DNA甲基化修饰试剂盒说明书制备CT Conversion Reagent和M-Wash Buffer。注意CT Conversion Reagent应现用现配，避光保存。收集 研究组胃癌细胞株MKN45和MKN28、对照组白 血病细胞株K562各1×10³个细胞直接进行蛋白酶 K消化（无需提取DNA）、130 μl CT Conversion Reagent进行Bisulfite修饰、柱内600 μl M-binding Buff er及100 μl M-Wash Buff er脱盐纯化、200 μl M-Desulphonation脱磺基、10 μl M-Elution Buffer洗脱 修饰后的DNA进行MSP检测或−20℃避光保存备用。 1.2.4 MSP检测SHP1基因甲基化状态

甲基化PCR引物设计软件MethPrimer设计的 两对引物M-MSP、U-MSP均用于经Bisulfite修饰 后的DNA模板扩增，其中引物M-MSP用于扩增甲 基化DNA，引物U-MSP用于扩增未甲基化DNA， 引物相关数据见表 1。MSP反应体系25 μl，其中 Bisulfite修饰后基因组DNA模板4 μl，10×缓冲液 2.5 μl，上游和下游引物（5 μM）各1 μl ，dNTP 各 Mix（2.5 μM）2 μl、MgCl2（25 mM）3 μl、Taq™ DNA （1U）0.5 μl，去离子水11 μl。扩增循环条 件：95℃ 预变性10 min后，94℃变性30 s，58℃退 火30 s，72℃延伸7 min，扩增38个循环，72℃延 伸5 min。MSP产物经2%琼脂糖凝胶电泳，GelRed 染色，用紫外检测仪Tanon 3500凝胶图像分析系统 观察检测结果。 1.2.5 克隆、测序质检SHP1基因序列

用胶回收试剂盒（AxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit）回收并纯化MSP产物159 bp目的片 段，克隆至pMD19-T载体，在10 μl体系(含Solution I 5μl，pMD19-T 1 μl，MSP回收产物4 μl)中于16℃ 下连接16 h，转化感受态DH5α，冰浴30 min后 42℃热激90 s，加入不含抗生素的（SOC）培养液 37℃复苏40 min。取复苏后菌液100 μl涂布于LB/ 氨苄青霉素平板，涂布均匀后放入37℃培养箱中 培养过夜。挑取6个白色单克隆菌落做PCR扩增验 证，同时挑取一个蓝色菌落做为对照。经菌落PCR 及电泳鉴定后，阳性克隆为单一条带，产物大小符 合，PCR产物委托英潍捷基（上海）贸易有限公司（Life technologies TM）进行Sanger测序。 1.2.6 分析SHP1基因序列及启动子区域CpG位点

应用甲基化分析软件对亚硫酸盐修饰后胃 癌细胞SHP1基因启动子区域测序数据进行序列 分析：BLAST结合Chromas软件分析测序峰图， QUMA（http://quma.cdb.riken.jp/）在线软件比较 Bisulfite修饰前后序列变化并分析CpG位点甲基化 状态。 1.3 结果判定标准

甲基化特异性引物扩增（M-MSP）呈阳性条 带，非甲基化特异性引物扩增（U-MSP）呈阴性 条带提示该样本基因启动子区呈高甲基化状态； 如U-MSP呈阳性条带，而M-MSP呈阴性条带，则 提示该基因启动子区呈非甲基化状态；如两者均 出现阳性条带者为部分甲基化，亦判定为该基因 启动子呈甲基化状态。对MSP产物进行克隆测序 进一步判断CpG位点是否发生甲基化：M-MSP阳 性条带者，测序示CpG二核苷酸中的碱基C被亚硫 酸氢钠修饰后仍旧为C，则证实该位点为甲基化状 态；U-MSP阳性条带者，测序示CpG岛CpG二核苷 酸中的碱基C被亚硫酸氢钠修饰再经PCR扩增后变 为T，则证实该位点为非甲基化状态。 2 结果 2.1 SHP1基因转录起始位点CpG岛分析及MSP引物设计

用Cpgplot软件及MethPrimer v1.1 beta分析CpG 岛结果显示：GC含量>50%、CpG含量与期望含量 之比（observed/expected，Obs/Exp）>0.60、CpG 岛长度>200 bp，表明CpG双核苷酸相对聚集，见 图 1。MethPrimer软件引物设计及Blast验证MSP 引物结果表明：甲基化（M-MSP）和非甲基化 （U-MSP）两对引物均位于SHP1基因第一外显子 区近转录起始位点，MSP引物含有9个CpG位点， 严谨度很高，扩增序列特异性强，采用55℃~62℃ 梯度摸索最佳条件为58℃，见表 1。

Criteria: GC percent > 50.0, Obs / Exp > 0.60, island size > 200m 图 1 MethPrimer软件分析SHP1基因转录起始位点上游 CpG岛 Figure 1 CpG islands in SHP1 transcription start site(TSS) analyzed by MethPrimer software

表 1(Table 1)

表 1 SHP1基因MSP引物序列 Table 1 Primer sequences of SHP1 gene in methylationspecific PCR(MSP)

表 1 SHP1基因MSP引物序列 Table 1 Primer sequences of SHP1 gene in methylationspecific PCR(MSP)

利用BLAST（basic local alignment search tool，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分析经Bisulfite修 饰后的胃癌细胞SHP1启动子区域Sanger测序数据， 同时结合Chromas软件对测序峰图进行分析，序列 比对结果正确，表明测序正确。使用甲基化测序结 果分析软件QUMA（http://quma.cdb.riken.jp/）将 Bisulfite修饰前后的SHP1启动子区序列整齐排列， 并比较非甲基化C→U→T转化及CpG甲基化位点， 结果显示SHP1基因启动子区域的DNA序列中含有 大量的CpG岛，且CpG岛非甲基化DNA经Bisulfite 修饰后C变为U，经PCR扩增变成T，说明胃癌细胞 中SHP1基因确实存在甲基化状态，见图 2。

图 2 Bisulfite修饰前后SHP1启动子区域部分序列的比较及 CpG甲基化位点 Figure 2 Partial sequences of SHP1 promoter region before and after Bisulfite modification and CpG methylation sites

M-MSP引物扩增产物阳性条带159 bp者表明 存在DNA甲基化，应用U-MSP引物出现扩增产物 阴性条带161 bp者即为不存在DNA甲基化，若同时 出现扩增产物则考虑存在部分DNA甲基化。结果 表明对照组K562细胞SHP1基因M-MSP引物扩增呈 现条带，表现为高甲基化，与文献报道结果一致^[3]。 胃癌细胞MKN45和MKN28中SHP1基因启动子区 CpG岛M-MSP引物都出现扩增条带，而U-MSP引物无扩增条带，表现为高甲基化（仅出现甲基化 条带），见图 3。

Marker: DL2000 DNA marker;M: PCR product with specific PCR primes for methylated DNA;U: PCR product with specific PCR primes for unmethylated DNA;K562: control group 图 3 MSP检测SHP1基因启动子区CpG岛甲基化 Figure 3 Methylation-specific PCR detection of CpG islands methylation in SHP1 gene promoter region

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，近年来 胃癌发病率及死亡率居高不下，且年轻化速度越 来越快，主要原因是人们对胃癌的发病机制尚未 彻底了解，缺乏有效的早期诊断及防治措施。因 此，揭示胃癌的发生发展机制，对其进行有效的 早期预警、早期诊断、早期防治显得尤为重要。 抑癌基因DNA的异常甲基化是肿瘤发生发展的一 条重要途径，当肿瘤抑制基因发生高甲基化，可 造成相关基因表达沉默，出现细胞以缺失或突变 的方式恶性生长。研究表明DNA甲基化发生在细 胞恶变之前，因此检测DNA启动子区是否发生了 高甲基化有助于早期发现突变细胞^[10]。

SHP1基因定位于12p13，由含有17个外显子 并含有2.4~2.6 Kb转录长度的横跨大约17 Kb的 DNA组成。含有SH2的SHP1基因主要表达于造 血细胞，在生长因子受介导的信号转导过程中具 有重要的负性调控作用，是造血细胞恶性肿瘤的 抑癌基因^[11]。SHP1能调控JAK发生去磷酸化而阻 断JAK/STAT信号通路，其功能丢失使JAK激酶活 性增高，并导致细胞的过度增殖^[12]。研究表明， SHP1在白血病^[4]、淋巴瘤^[5]、多发性骨髓瘤^[10,13]、 结肠癌^[14]等肿瘤组织中表达失活主要是由于其启 动子区CpG岛的特异性高甲基化所致。SHP1基因 作为淋巴瘤、白血病等肿瘤的分子诊断标志及治 疗新靶点已经引起了人们的广泛关注^[6]。目前，国 内尚缺乏对胃癌细胞中SHP1基因启动子分析的报 道，本实验结果显示，SHP1基因转录起始点附近 序列富含CpG二核苷酸，形成9个CpG位点，存在 高甲基化的条件。

MSP法是一种快速、实用的基因甲基化检测 方法，敏感度高，特异性强^[15]，定量分析SHP1基 因启动子区CpG岛甲基化水平，可以更好地揭示 SHP1启动子区CpG岛所包含的表观遗传学信息， 明确DNA甲基化模式在SHP1基因差异表达机制中 的作用^[16]。本实验通过建立一种无需提取DNA、 可直接用少量细胞进行甲基化检测的、基于 Bisulfite修饰的MSP方法，并用此方法研究了胃癌 细胞中SHP1基因启动子区域CpG岛甲基化状态。结果显示，胃癌细胞MKN45和MKN28中SHP1基 因启动子区CpG岛甲基化特异性引物出现扩增条 带，而非甲基化特异性引物无扩增条带，表现为 高甲基化。测序结果显示在SHP1基因启动子区域 的DNA序列中含有大量的CpG岛，所检测的DNA 序列跨越了SHP1基因的转录起始位点，表明胃癌 细胞中SHP1基因启动子区CpG岛存在DNA的高甲 基化，提示SHP1基因启动子区域的DNA甲基化状 态与SHP1基因的表达之间存在较为密切的联系。 以上实验结果初步显示与大多数抑癌基因如P16、 MGMT、THBS1、Runx3、CDH1、RASGRF1等相 似^{[17, 18, 19]} ，抑癌基因的表达水平和其启动子区域的 DNA甲基化水平呈负相关，进一步证实了基因启 动子区高甲基化可导致该基因表达缺失，甲基化 修饰可能是导致胃癌SHP1基因失活的机制之一。

对某一特定肿瘤建立一个涉及多个肿瘤相关 基因的 DNA甲基化谱式，有利于肿瘤的早期诊断 或鉴别诊断^[20]。SHP1基因启动子区域甲基化的研 究也为丰富胃癌 DNA的甲基化谱式提供了实验数 据。研究结果表明，胃癌细胞中存在SHP1基因启 动子CpG岛高甲基化，通过对SHP1基因进一步深 入研究，有助于阐明SHP1启动子CpG岛甲基化与 胃癌发生发展的关系，为胃癌的早期筛查及靶向 生物治疗提供科学依据。