抗CD3和抗肿瘤抗原的双功能抗体如：抗 CD3/抗Pgp、抗CD3/抗CD20和抗CD3/抗CD19 ^[1]等 能够将活化的T淋巴细胞靶向至肿瘤细胞，从而 在体外和体内介导特异性杀伤作用，是一种很有 潜力的治疗恶性肿瘤的方法^[2]。淋巴细胞作为抗 肿瘤免疫过程中的主要效应细胞，其激活程度以及活化后的状态是关键因素之一。近年来，抗体 和临床一线化疗药物联合应用越来越受到推崇。 两者联合应用，可以减少抗体用量，降低药物成 本，同时也可以降低化疗药物使用剂量，从而降 低化疗药物的细胞毒性作用，减少不良反应的发 生。同时联合应用的疗效较单独用药更好。T细胞 活化需要协同刺激信号，否则T细胞不但不能有效 活化，还会处于无能状态。B7是协同刺激分子最 主要的家庭成员，它包括两种分子CD80（B7-1） 和CD86（B7-2）。文献报道，化疗药物阿糖胞苷 （Ara-C）能够诱导肿瘤细胞高表达B7分子^[3]。因 此，推测本实验构建的双功能抗体和Ara-C联合应 用可以更有效地活化T细胞，增强T细胞的活性， 获得更显著的治疗效果。 1 材料与方法 1.1 双功能抗体的表达与纯化

抗CD3/抗CD19双功能抗体的构建、表达及活性测定由本实验室完成^[4]。抗CD3单 链抗体（antiCD3scFv）、抗CD19单链抗体（antiCD19scFv）由天津市肿瘤防治重点实验室表 达、纯化并保存。 1.2 细胞株及细胞培养

人B白血病细胞系Nalm-6细胞株由本实验室 常规细胞传代培养，悬浮培养于RPMI 1640培养 液中，含10%的胎牛血清，于37℃、CO₂体积分数 为5%的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实 验。 1.3 试剂及仪器

阿糖胞苷（Ar a- C）购自GE公司；MTT为 Sigma公司产品；小鼠抗人CD86/PE标记抗体，小 鼠抗人CD80/FITC抗体及同型抗体均购自晶美生 物工程有限公司；兔抗鼠FITC标记二抗、胎牛血 清购自中国医学科学院血液学研究所科技公司； 小鼠抗人CD25/FITC抗体，小鼠抗人 CD69/PE抗 体，小鼠抗人CD2/APC IgG抗体及同型抗体均购自 美国BD公司；IL-2购于北京四环生物制药公司； Calcein-AM荧光染料购于美国Anaspec公司；流式 细胞仪为美国Becton-Dikinson公司产品。 1.4 MTT法测定阿糖胞苷对Nalm-6细胞的细胞毒性

取对数生长期Nalm-6细胞，调整细胞密度为 1×10⁶/L，加入终浓度为0.125～32 µM（倍比稀 释）的Ara-C，37℃共同温育72 h后，调整细胞浓 度为5.5×10⁴/ml，于96孔板中加入细胞悬液180 μl 及20 μl 5 μM的MTT，每浓度阿糖胞苷实验组加3 个复孔，继续培养4 h后，300 g离心去上清液，用 150 μl DMSO溶解析出的甲瓒，检测OD570吸光度 值，计算各组细胞的活力，并绘制生长曲线。 1.5 FACS测定阿糖胞苷作用Nalm-6细胞后CD80和CD86分子表达变化

取对数生长期的Nalm-6细胞，用锥虫兰拒染 法计数活细胞数，调整细胞密度为1×10⁹/L，加入 终浓度为0.25 μM的Ara-C，于37℃、5%CO₂孵箱 中孵育培养72 h，以未经Ara-C处理的Nalm-6细 胞作为对照组，同时加入等体积的PBS。收集细 胞，用PBS洗2次，分别加入PE标记的CD86抗体和 FITC标记的CD80抗体，同时分别设立同型对照， 按照说明书操作步骤，避光，4℃反应30 min，于 FACS上检测。每个样品计数1×10⁴个活细胞数。其 结果用CELL Quest 软件分析。 1.6 双功能抗体联合阿糖胞苷介导的体外杀伤活性的测定

健康成人富含血小板白膜（天津市血液中心 提供）经密度梯度离心法(Ficoll-Hypaque)分离后 得到单个核细胞，在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液中，于37℃、CO₂体积分数为5%的条件下 培养2 h后，保留非贴壁的外周血淋巴细胞，调整 其密度为3×10⁶/ml，加入重组人IL-2至终浓度为50 u/ml，继续培养72 h。收集PBL细胞，用PBS洗2 遍，PBS重悬细胞调整密度为1×10¹¹/L，每毫升细 胞加入10 μl直标抗CD2/APC抗体4℃温育1 h，灭 菌300目尼龙网过滤后，流式细胞仪分选CD2 + T细 胞备用。利用Calcein-AM荧光染料测定靶细胞杀 伤，具体实验步骤如下：(1) 取对数生长期Nalm-6 细胞，调整细胞密度为1×10⁹/L，加入终浓度为 0.25 μM的阿糖胞苷，共同温育72 h后，收获细 胞。并同时收获对数生长期Nalm-6细胞。(2) 接种 靶细胞（Nalm-6）和效应细胞T细胞到96孔板：调 整靶细胞密度为1×10⁹/L，加入终浓度为10 μM的 Calcein-AM的RPMI 1640培养液温育细胞1h后， 按照每孔2×10⁸/L加入96孔板，每孔50 μl。(3) 效应 细胞按效靶(E:T)比25:1、12.5:1、6:1和3:1分别加入 T细胞体积共50 μl，并且设立分组加入不同浓度的 （10.0、1.0、0.1 pM）不同类型的对照组抗体，每种 实验孔设3个复孔，同时设立靶细胞自发释放和最 大释放对照组。1种抗体浓度/1组效靶比分组如下： ①T+PBS+Nalm-6；②T+抗CD3/抗CD19双功能抗体 +Nalm-6；③T+抗CD3scFv/抗CD19scFv+Nalm-6； ④T+抗CD3/抗Pgp双功能抗体+Nalm-6；⑤Nalm-6 细胞自发释放，即Nalm-6+50 μl RPMI 1640培养液；⑥Nalm-6细胞最大释放，即收集上清液前45 min加入终浓度为2% TritonX-100 37℃、5% CO₂孵 育45 min。

将Nalm-6细胞替换为Ara-C刺激后的Nalm-6细 胞重复上述分组。加样后250 g离心4 min，使效 应细胞和靶细胞接触。在37℃、5%CO₂条件下培 养4 h后，离心300 g，5 min，各组分别取上清液 80 μl，用Fluoroskan Ascent FL（Thermo）荧光酶 标仪测定荧光强度，激发波长为485 nm，发射波 长为535 nm。按下式计算特异性杀伤的百分率： 细胞特异杀伤百分比（%）＝（实验组-靶细胞自 发释放）/（靶细胞最大释放-靶细胞自发释放）× 100%。 1.7 激活的T淋巴细胞表面标记CD25、CD69测定

分别取上述杀伤实验Ara-C刺激组和未刺激 组，效靶比25:1，双抗10.0 pM组细胞，PBS重悬 细胞调整密度为1×10⁸/ml，每毫升细胞加入10 μl 抗CD2/APC、抗CD25/FITC、抗CD69/PE IgG抗体 4℃温育1 h，FACS检测CD25、CD69表达。 1.8 激活的T淋巴细胞释放细胞因子IL-2测定

分别取上述杀伤实验Ara-C刺激组和未刺激 组，ELISA法检测效靶比25:1，双抗10.0 pM组中 各实验孔激活的T细胞释放IL-2的量并比较，具体 步骤参照说明书。 1.9 统计学方法

实验数据经Student’s t检验，采用SPSS 18.0软 件进行统计学处理，结果以平均值±标准差表示。 以P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 MTT法测定Ara-C对Nalm-6细胞的细胞毒性

Nalm-6细胞加入不同浓度的Ara-C，温育72 h 后，MTT法测量活细胞数，并绘制生长曲线，测 得IC₁₀=0.25 µmol/L，见图 1。 后，检测CD80和CD86表达。与0 h比较CD80表达 明显升高，CD86表达无明显变化，见图 2。

图 1 MMT法测定Ara-C对Nalm-6细胞的生长抑制率 Figure 1 Inhibitory effects of Ara-C on the growth of Nalm-6 detected by MTT

**:P<0.01,compared with 0h 图 2 Ara-C刺激Nalm-6细胞72h后CD80和CD86的表达 Figure 2 Expression of CD80 and CD86 in Nalm-6 cells stimulated by Ara-C for 72h

在双功能抗体存在的情况下，激活的T淋巴细 胞能够特异性杀伤靶细胞，在相同浓度相同效靶 比下杀伤效率明显强于对照各组（P<0.05），见 图 3。随着抗体浓度的增高，E/T比增加，激活的T 淋巴细胞亚群裂解杀伤靶细胞的作用逐渐增强， 见图 3。

Cytotoxicity of T cells on Nalm-6 cells (A) or Nalm-6 cells stimulated by Ara-C (B) mediated by bispecific antibody at different concentrations and various E/T ratios. Cytotoxicity of T cells on Nalm-6 cells (C) or Nalm-6 cells stimulated by Ara-C (D) at different E/T ratios in the presence of PBS, a mixture of the antiCD3scFv and antiCD19scFv, bispecific antibody, or the antiCD3/antiPgp bispecific antibody. 图 3 T细胞在不同浓度双抗不同效靶比下的细胞毒作用 Figure 3 Cytotoxicity of T cells at different E/T ratios mediated by different concentrations of bispecific antibody in a nonradioactive cytotoxicity assay

体外杀伤实验中，T淋巴细胞被不同程度激 活，大量杀伤靶细胞，T细胞被激活后的表面标记 CD25和CD69表达量也不同程度升高，双功能抗 体介导的T细胞表面CD25（图 4A）和CD69（图 4B）较其他组均明显升高（P＜0.05），Nalm-6 （Ara-C）组升高程度虽然比Nalm-6组更明显，但 两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

1:T+PBS;2:T+diabody;3:T+antiCD3scFv+antiCD19scFv;4: T+antiCD3/antiPgp;*:P<0.05,compar ed with 1,3 and 4;**: P<0.01,compared with 1,3 and 4 图 4 激活的T淋巴细胞CD25(A)和CD69(B)的表达 Figure 4 Expression of CD25 (A) and CD69 (B) in activated T lymphocytes

根据实验孔测得的OD值代入标准曲线，得 到IL-2释放量的绝对值，可见双抗组IL-2的释放 较其他组明显增高（P＜0.05），其余各组间差异 无统计学意义（P＞0.05），且经Ara-C刺激后的 Nalm-6细胞较未经Ara-C刺激的Nalm-6细胞升高更 明显（P＜0.05），见图 5。

1:T+PBS;2:T+diabody;3:T+antiCD3scFv+antiCD19scFv;4: T+antiCD3/antiPgp;**:P<0.01,compared with 1,3 and 4 图 5 激活的T淋巴细胞IL-2的分泌 Figure 5 Secretion of IL-2 in activated T lymphocytes

T细胞是抗肿瘤免疫的主要效应细胞，其活化 状态同治疗的效果密切相关。T细胞在增殖分化 中如果受到某些抑制信号的调节，例如肿瘤细胞 分泌的某些细胞因子的抑制作用，则可能会出现 细胞死亡或者无能状态，从而导致抗肿瘤免疫功能低下。为了激活T细胞对抗肿瘤，必须发展能够 克服肿瘤逃脱免疫系统和限制免疫系统对其免疫 应答方式（比如通过CTLA-4^[5]）的策略。有研究 曾将抗CD3/抗Pgp diabody与共刺激分子4-1BBL联 用，体内、外实验结果表明抗CD3 /抗PGP diabody 所介导的靶向体外激活的T细胞杀伤耐药肿瘤细胞 的作用明显增强，停止治疗后没有出现肿瘤复发 生长的现象^[6]。也有文献报道，在应用双功能抗体 的同时联合应用抗CD28抗体或B7生物工程片段可 显著提高双功能抗体所介导的T细胞杀伤活性，降 低双功能抗体的用量^{[7, 8, 9]}。

此类研究虽然取得了一定的进展，但是还存 在缺陷，如：联合应用的共刺激分子多为抗体或 生物工程片断，制备成本较高，产量有限，作为 外来抗原应用于人体会产生一定的毒副作用，难 以满足临床应用的需求。上述缺陷的存在限制了 双功能抗体的应用。

肿瘤细胞可表达肿瘤抗原，并有一定的免疫 原性，但很多情况下其免疫原性不足以引起T细胞 有效地免疫应答。如研究表明绝大多数小鼠恶性 肿瘤细胞均不表达B7分子。检测小鼠肿瘤细胞B7 基因的表达中发现，所检测的18个细胞系中，只 有4种表达B7-1分子，而且均来源于B细胞系的淋巴 瘤细胞，其余14种细胞系均不表达B7-1分子^[10]。这 些缺乏B7等协同刺激分子表达的肿瘤细胞不能为 T细胞活化提供足够的第二信号，也就无法有效诱 导免疫应答。有报道化疗药Ara-C可以诱导白血病 细胞表达B7分子^[11]。基于上述事实，我们期望应 用化疗药物刺激肿瘤细胞共刺激分子表达上调， 避免了应用生物工程产物带来的弊端，又降低了 成本，同时联用双功能抗体将T细胞靶向至靶细胞 周围，能更有效地特异性地活化T细胞从而杀伤肿 瘤细胞。

Nalm-6细胞是人B淋巴细胞白血病，B7分子 的表达呈弱阳性。本实验通过MTT实验确定了可 以刺激Nalm-6细胞B7表达升高，又不显著抑制其生长的Arc-C低毒性浓度（IC₁₀）。将抗CD3/抗 CD19双功能抗体与Ara-C联用，体外观察T细胞的 杀伤效果，结果表明抗CD3/抗CD19双功能抗体所 介导的体外激活T细胞杀伤肿瘤细胞的作用明显强 于没有经过Ara-C刺激的Nalm-6细胞，并且与双功 能抗体的剂量以及效靶比存在依赖关系。同时T细 胞表面标记CD25和CD69的表达显著升高，IL-2的 释放明显增高，上述结果都验证了Ara-C刺激后的 Nalm-6细胞可以更有效地激活T细胞，使其能更有 效地杀伤靶细胞，从而证明化疗药物和双抗联合 应用的有效性。贾秀红等^[12]研究也证实了这一点。

本实验应用低毒性浓度（IC₁₀）AraC，该浓度 细胞毒性极低，临床应用时不会对机体产生明显 的毒副作用，而该浓度又可以有效地使肿瘤细胞 表面辅助刺激分子表达升高，联合应用双功能抗 体后，可以募集自体的T细胞靶向至靶细胞周围， 有效的活化T细胞产生杀伤作用。因此，双抗和化 疗药联合这一新型治疗手段，成本低，毒副作用 小，效果明显，本实验为今后的临床应用提供了 有价值的依据。