利用光来治疗疾病已有上千年的历史，随 着光医学的发展，光动力学疗法的理念逐步建 立^[1]，近40年来，光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）在治疗恶性肿瘤的领域得到认可 并成为新的肿瘤治疗方法。PDT是利用光敏剂和 相应波长的光线来引起靶组织（肿瘤细胞）的细 胞凋亡、细胞坏死、血管破坏以及局部免疫作 用，从而诱导细胞毒性作用的治疗方法^[2]。可以 说光敏剂的开发和发展在PDT的建立和发展中起 着关键性作用。第一代光敏剂有血卟啉衍生物 （hematoporphyrin derivative,HPD）、二血卟啉酯 或Porfimer sodium（Photofrin）等，第二代光敏剂 主要有卟啉类的衍生物、外源性卟啉。第二代光 敏剂具有组成和结构明确、体内代谢快、作用光 波的波长较长、靶组织选择性高等优点，部分克服了第一代光敏剂的缺点。

本研究将水溶性良好的Photodithazine（二氢 卟吩e6葡萄糖衍生物）作为光敏剂^{[3, 4]}，对小鼠B细 胞淋巴瘤进行光动力学治疗。通过体内外实验， 观察Photodithazine/PDT对A20细胞的杀伤效应及 A20淋巴瘤动物模型的抗肿瘤效果，并探讨其可能 的作用机制。 1 材料与方法 1.1 细胞培养

A20细胞株是小鼠B细胞淋巴瘤，获赠于韩国 汉阳大学Joong-Soo Han教授。细胞培养液用添加 10% fetal bovine serum（FBS,Gibco-BRL），0.37% sodium bicarbonate（Amresco,Solon,Ohio）， streptomycin/penicillin（Gibco-BRL）的RPMI 1640 培养液，并在37℃ CO₂下培养。 1.2 体外光动力学治疗和光学显微镜下观察

光敏剂是水溶性二氢卟吩e6衍生物Photodithazine（ZAO Veta,Moscow,Russia）获赠 于JeongHuan Lee教授（Diatech Korea）。在96孔 细胞培养板中按每孔6×10³个细胞种植，24 h后将 浓度为0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 μg/ml光敏剂和 培养液的混合液来置换原有培养液。在培养液里 避光培养12 h后，去除含有光敏剂的培养液。再暗 室照射6 J/cm²的663 nm激光。体外光动力学治疗 24 h后，在光学显微镜（Olympus,Japan）下观察 细胞形态的变化。 1.3 水溶性四氮唑（WST-1）细胞增殖检测

体外光动力学治疗后，在96孔细胞培养板的 每个孔加入10μl WST-1溶液 （Beyotime）。37℃ 培养1 h后将96孔细胞培养板在振动器上轻轻搅匀 10 s，酶标仪在450 nm处测吸光度值，检测连续进 行4日。 1.4 体外光动力学治疗后细胞凋亡的检测

采用Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪来 检测。 体外光动力学治疗48 h后，离心弃去培 养液的方法收集细胞。每样本细胞数为（1~5）×10⁶/ml，900 g/min离心5 min。 用孵育缓冲液 （10 mmol/L HEPES/NaOH，pH 7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl₂）洗涤1次，900 g/min离心 5 min。用孵育缓冲液重悬细胞，添加5 μl Annexin V-FITC solution（BD,Flanklin Lakes,NJ）室温下 避光孵育（10~15）min。900 g/min离心5 min， 沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。加入10 μl PI solution （100 μg/ml,BD）溶液4℃下孵育20 min，避光并 不时振动。流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光 波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器 检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检 测PI。 1.5 动物模型的建立和体内PDT

1×10⁶的A20细胞种植在雌性Balb/c小鼠皮下。 待肿瘤直径平均约8 mm时随机分为4组：对照组、 光敏剂组、照射组及PDT组（即光敏剂+照射）。 PDT实施后每2~3 d用caliper测定肿瘤的长轴（a）, 短轴（b），高度（c），肿瘤的体积按a×b×c来计 算，肿瘤大小来分析PDT效果。体内PDT实施方 法：静脉内注射每公斤体重10 mg的光敏剂，3 h后 用光纤维导出相应波长的激光，照射于肿瘤上， 来激活堆积在肿瘤上的光敏剂。所使用的激光总 照射量为300 J/cm²，照射直径为1 cm，照射时间为 10 min。一部分实验动物在PDT治疗48 h后死亡， 采集肿瘤组织，立即放入液氮，待提取蛋白质。 部分动物分别在左右侧各种植细胞，一侧未进行 PDT治疗，另一侧进行PDT治疗，以便肉眼直接观 察肿瘤大小变化。 1.6 蛋白质提取和Western blot

将肿瘤组织用预冷的PBS冲洗2次，擦干水 分后加入液氮捣碎组织。将组织粉末移入1.5 ml microtube后加入细胞裂解液，4℃静置30 min。 12 000 r/min离心10 min，取上清液，用Brad-ford 法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转 移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h。随后分 别加入P21、P53、PARP及b-actin（santacruz）等 抗体，室温孵育2 h，用TBST漂洗3次，再加入相 应的二抗，孵育1 h，用TBST漂洗3次。电化学发 光（ECL），暗室曝光，洗片显示蛋白条带。 1.7 统计学方法

所有数据采用SPSS 11.0统计软件进行分析。 数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比 较采用t检验，各组间比较采用析因分析，P<0.05 差异有统计学意义。 2 结果 2.1 A20细胞的特性

A20 细胞起源于一个网状细胞肿瘤，属Balb/c 小鼠的B细胞淋巴细胞系，以淋巴母细胞的形态生 长。B细胞特异性抗体CD45R在A20细胞高表达， 见图 1A、1B。A20细胞的形态均匀，在400倍光学 显微镜下显示为表面光滑，中心部较暗边缘明显 的球形细胞，见图 1C。

CD45R was highly expressed on the surface of A20 cells(A:isotype antibody;B:CD45R antibody). Morphology of A20 cells before and after PDT were observed(C:control;D:PDT). Cellular swelling(red arrow) and shrinkage(yellow arrow) were observed simultaneously in the same field, 24h after 0.50 μg/ml Photodithazine/PDT treatment. Bar:50 μm 图 1 A20细胞株中CD45R的表达及形态学变化 Figure 1 CD45R expression and morphological changes in A20 cell line

体外研究中PDT后A20细胞形态有了明显的变 化：细胞表面出现伪足，细胞肿胀或收缩，见图 1D。作为对照，设置了三种细胞：分别为对照组 （未进行任何处理的细胞），照射组（仅进行激 光照射的细胞），光敏剂组（只添加0.5 μg/ml光敏 剂而未进行激光照射的细胞）。此三组细胞形态 在光学显微镜下均未见明显变化。体外光动力治 疗的细胞，即不同浓度光敏剂处理后激光照射的 细胞中不同程度出现了细胞数目的减少和形态变 化。PDT治疗24 h后，在低浓度0.125 μg/ml PDT组 中细胞的形态学变化也不明显，自0.25 μg/ml开始 PDT后上述变化比较明显，0.75 μg/ml PDT及以上 浓度PDT后几乎全部细胞形态变形。使用不同浓 度光敏剂，PDT后A20细胞体外增长均受到抑制， Photodithazine浓度越大，所测定出的OD吸光度越 小。24 h后0.50 μg/ml浓度以上PDT组的细胞生长 受到了抑制（P<0.05），48 h后0.25 μg/ml浓度组 细胞生长较对照组也明显抑制（P<0.01）。治疗24 h 后对照组、照射组及光敏剂组的增殖十分相近， 与对照组相比0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 μg/ml 光敏剂PDT治疗组的细胞生长率分别为（103.0± 3.4）%，（99.7±4.6）%，（77.5±4.2）%，（38.9 ±8.6）%，（9.9±2.1）%；48 h后分别为（95.0± 3.0）%，（88.8±2.9）%，（58.1±3.1）%，（21.8 ±0.7）%，（7.0±0.9）%，见图 2。

A20 cells ( 1×106) were incubated with variousdoses of Photodithazine(0.125-1.0μg/ml)for 12 h at 37℃ and exposed to 6.25 J/cm2 of laser light. The treated cells were further incubated at 37 ℃ for 4 days for WST-1 assay. (*:P< 0.05, **:P<0.01 in t-test with the control group) 图 2 Photodithazine/PDT 实施后淋巴瘤细胞的生存率 Figure 2 The survival rate of lymphoma cells after Photodithazine/PDT

PDT后24 h，Annexin V/PI双染色流式细胞分 析用于区分凋亡及坏死细胞。流式细胞仪结果， 见图 3。右下象限代表早期凋亡细胞，右上象限 代表晚期凋亡细胞和坏死细胞。在对照组、照射 组、光敏剂组、各浓度PDT治疗组中早期细胞凋 亡率分别为3.5%、4.9%、3.8%、5.5%、8.5%、 8.8%、8.8%、0.4%；除左下象限外三个象限所 占细胞比率为13.3%、14.3%、14.2%、16.7%、 21.7%、36.1%、60.1%、93.9%。

图 3 Annexin V/PI染色后各组A20细胞的细胞凋亡及坏死 Figure 3 Apoptosis and necrosis of A20 cells in each group after Annexin V/PI staining

自种植1×10⁶的A20细胞4日起可触及皮下结 节，约16日时肿瘤长轴可达8 mm，边界清楚， 见图 4A、4B。形成肿瘤后处死部分实验动物， 提取种植物进行了形态学观察。HE染色显示： 光学显微镜下瘤细胞大小比较一致，弥漫分布， 核大深染，核圆形、卵圆形或不规则形，核染色 质不均匀，胞质极少；用CD45R免疫组织化学染 色后见：所有肿瘤细胞表面深染为棕色，强表达 CD45R，见图 4C、4D。

A: typical large B-cell lymphoma(HE staining); B: atypical lymphoid cells in all regions were clearly stained by CD45R(Immunohistochemistry staining of CD45R). Scale bar: 500μm. The tumor volume was reduced with PDT(C,D left side) compared with that without PDT(C,D right side) 图 4 肿瘤组织的镜下形态及PDT治疗后肿瘤的生长变化 Figure 4 Microscopic findings of tumor tissues and growth changes after PDT

光动力治疗后，对照组肿瘤仍继续增大， 各径线变长，较对照组PDT组平均肿瘤生长缓 慢，自2周始肿瘤体积减小，差异有统计学意义 （P<0.05），见图 5。从肿瘤组织中提取的蛋白质 表达分析示：P21、P53、Bax 等蛋白的表达比对 照组增加。

A: Tumor volume was measured and calculated every 2-3 days. Tumor growth was inhibited in PDT group versus that in control group ( *:P<0.05);B:Western blot analysis was performed to detect the expression of apoptosis-assotiated protein in tumor tissues, after Photodithazine/PDT treatment for 48h 图 5 Photodithazine/PDT实施后肿瘤的生长曲线及肿瘤组织的蛋白表达 Figure 5 Tumor growth curves and protein expression of tumor tissues after Photodithazine/PDT

PDT在肿瘤治疗中，通过利用光敏剂和特定 波长光照射后，一系列光动力反应所产生的单线 态氧来选择性破坏肿瘤的。PDT以化学、光物理 学、生理学为基础，结合其他领域的多学科综合性很强的自然学科。为了提高光敏剂的吸收、增 强选择性及快速代谢，各国研究者致力于新的光 敏剂的开发和研究。Photofrin是第一个被批准应用 的光敏剂，目前已在十多个国家获得政府药监部 门批准，用于食管癌、肺癌、膀胱癌、宫颈癌与 皮肤癌的治疗。第二代光敏剂中对5-氨基酮戊酸 （5-ALA）的研究较多，它是血红素的前体，在机 体内经一系列酶促作用，转化为光敏性强的原卟啉 Ⅸ衍生物（PPⅨ），聚集在肿瘤细胞内的PPⅨ，经 激光照射后发生光动力反应，杀伤肿瘤细胞。

本研究选用俄罗斯开发研制的Photodithazine （化学名：N-dimethyl glucamine chlorin），属于 第二代光敏剂，在较长的红色区域有密集的吸收带 （663 nm）^{[3, 4]}。Photodithazine在TC-1小鼠肺癌细 胞中主要被溶酶体吸收，小部分被线粒体吸收^[5]。 在此项研究中经6.25 J/cm²的激光照射24 h后，对 照组细胞存活率在0.25、0.5、0.75 μg/ml浓度时分 别约为84.1%、69.2%、28.0%，这与本次结果较 相近，但在各个浓度中对TC-1治疗效果更好，第 一，这可能与细胞形态有关：较A20细胞TC-1的细 胞体积大，附着于培养皿底部生长的有突起的细 胞，A20是球形表面光滑的浮游生长的细胞，故 在细胞表面积上有差异，接收照射面积有差异； 第二，由于A20细胞的形态和生长方式，在同样 的细胞存活研究中增加了起初种植细胞数目为每 孔6×10³细胞，最后是照射装备的不同可能小部分 影响到结果。但整体来说，Photodithazine/PDT抑制了肿瘤细胞的生长，且与光敏剂浓度增加而增 强。同样，对照组、照射组和光敏剂组三组的体 外各项实验效果十分相近，对A20细胞均无明显影 响^[5]。PDT治疗后电子显微镜下可观察到凋亡细胞 及坏死细胞；Annexin V/PI双染色流式细胞分析中 也观察到右下象限代表早期凋亡细胞，在各浓度 Photodithazine-PDT 后凋亡细胞和坏死细胞数目明 显增加。

A20细胞是B淋巴细胞系，通过尾静脉注射或 皮下注射细胞的方法，用作白血病或淋巴瘤的动物 模型来使用^{[6, 7, 8]}。在本研究中皮下注射1×10⁶的A20 细胞，成瘤率为100%，肿瘤组织形态学检查发现 呈典型的淋巴瘤，且高表达CD45R。因该模型造 模简单、肿瘤边界清楚、易测得肿瘤体积，是理 想的淋巴瘤动物模型。实际PDT应用中光的照射 方法对疗效起着很重要的作用。体内的照射方法 可分为：表面照射（Superficial illumination）、 间质内照射（Interstitial illumination）、管腔内 照射（Intraluminal illumination）、空洞内照射 （Intracavitary illumination）。根据肿瘤生长的方 式，选择合适的照射方法，大多数实验动物模型 采用的是皮下造模方式，故一直以来研究者多采 用间质内照射或表面照射方法^{[9, 10, 11]}。本研究中进 行体内照射方法是投药3 h后一次性表面照射， 照射范围为直径10 mm的圆形区域（肿瘤长径<8 mm）。实施体内PDT48 h后，见大多数肿瘤表面 中央部塌陷，肿瘤生长较对照组缓慢，但基底部 及部分边缘肿瘤组织仍有生长活性继续生长。若 此现象在临床中出现，第二期治疗中应该更改照 射方向或照射方法，治疗效果会更加明显。事实 上在PDT领先国家PDT光传导物质的研究和针对不 同部位肿瘤治疗的照射头研究也是非常积极和细 分化的。结果显示，不仅在体内实验中PDT后肿 瘤体积受到控制，肿瘤组织中提取的蛋白质经蛋 白印记法分析高表达抑癌因子及凋亡因子，分别 为P21、P53、Bax，这与其他光敏剂诱导的PDT在 各种肿瘤的治疗中通过调整P21、P53等蛋白的结 果是相近的^{[12, 13]}，也是一个预测中的结果。

PDT作为治疗肿瘤领域中兴起的治疗方法，因 其具有创伤小、毒性低、选择性和适用性好、可 重复治疗等多个优点，而受到越来越多的重视。 光敏剂、光源等核心要素的发展是PDT领域的关 键。世界各国的研究者正积极研发水溶性更好、 选择性更强、代谢更快、稳定性更好的第三代光 敏剂^{[11, 14, 15]}，而第三代光敏剂大多数是第二代光敏 剂的衍生物。只有掌握更多关于第一代、第二代 光敏剂对不同肿瘤的特性、效能和机制，才能将 其有效地应用最大化。