循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)， 是指循环系统中的肿瘤细胞，与肿瘤的转移密切 相关，对CTCs的检测为肿瘤的诊断、预后、药物 耐受和个性化治疗提供信息和依据。但CTCs在血 液中的含量极少，每10⁵~10⁷个外周血单个核细胞 中才有一个CTCs，CTCs在循环系统中易聚集成癌 栓，给计数造成一定的困难，所以，在检测CTCs 之前，必需要对标本进行富集^[1]。本综述主要讨论 CTCs的富集与检测方法。 1 CTCs的富集方法

CTCs富集方法分为非特异性富集方法和特异 性富集方法。非特异性的富集方法即利用CTCs 细胞本身的物理特性(如密度、大小等)进行富 集。特异性的富集方法是利用CTCs细胞表面的标 志物如上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、细胞角蛋白(cytokeratin， CK)等进行富集。特异性富集的一个主要限制因素 是：可能会漏掉不表达EpCAM或是其他分子标志 的CTCs细胞^[2]，导致CTCs富集不完全。但是特异 性富集方法仍然是目前运用最多的办法。 1.1 非特异性富集方法

包括密度梯度离心富集法、细胞大小富集 法、细胞变形性富集法、细胞电学特征富集法。

密度梯度离心富集法可分为两种：Ficoll法和 Oncoquick法。Oncoquick法在Ficoll离心法的基础 上做了改进，内置一个红细胞和部分白细胞可以 通过但是CTCs被保留下来的多孔屏障，提高了富 集效率。在一项对比试验中，用Oncoquick法富集 CTCs，测定61名患者CTCs阳性率是23%，而用特 异性富集Cellsearch法（一种免疫磁珠法）阳性率 是54%，说明Oncoquick法的敏感度还是有限。密 度梯度离心法昂贵，血液需要量大，敏感度低， 癌栓容易沉降到红细胞区，重复性较差，但是操作简便，可与其他富集方法联用(如免疫磁珠法)提 高富集效率。

细胞大小富集法可分为两种方法：上皮肿 瘤细胞大小分离(the isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)和微滤芯片技术。细胞大小富 集法可实现活细胞分选，且癌栓可检出，敏感度 相较于密度梯度法有所提高，但是较大血细胞被 富集会造成假阳性并且对于一些瘤细胞较小的癌 症(如小神经内分泌肿瘤细胞)无法检测。但在分选 的过程中加入阴性选择，排除一些较大的血细胞 后，再进行富集，可能减少假阳性率。

细胞变形性富集法：肿瘤细胞随着恶性程度 的增加，变形性增加，而且干细胞的变形性高于 分化的细胞。有研究^[3]运用肿瘤细胞的此种特性 设计了一个微流体芯片，检测一个混杂的乳腺癌 细胞系(SUM149)，发现有关肿瘤干细胞特异性分 子过度表达，而且这些细胞有很大的球体形成能 力，表明这些细胞具有干细胞样特征。目前，Hur 等^[4]综合利用肿瘤细胞变形性和肿瘤细胞大小特性 设计了一种微流体装置，由于每个细胞拥有其特 定的变形性和大小，在水流力的作用下，在微通 道内到达某一区域后达到力的平衡，细胞将不再 移动，可以将血细胞、恶性细胞、良性细胞分离 开来。利用细胞变形性的方法有潜力富集恶性程 度较高、具生物活性的肿瘤细胞，但该方法应用 于临床还有一定的困难。

细胞电学特征富集法：细胞的介电性质包括 膜容量、膜阻抗和胞质电导率，其随着细胞结 构和活动而变化，因而不同细胞有不同的介电 性质。用双向电泳-场流分离法(dielectrophoresisfield flow fractionation，DEP-FFF)测定9种肿瘤细 胞系和各种血细胞的介电特性，证明肿瘤细胞的 电容远大于各种血细胞^[5]。随后，他们比较了50种 实体瘤和各种血细胞的介电性质和密度，肿瘤细 胞被分离的频率远低于血细胞，频率的截断值是 65KHz ^[6]。Huang等^[7]在DEP-FFF体系中加入抗体 功能化的Hele-Shaw流动细胞(一种玻璃珠)，运用 DEP和免疫捕获手段协同富集CTCs，提高了富集 效率。电学特征富集法表现出了大于90%的分选效 率，其优点包括活细胞分选、使用灵活、容易调 控、便于自动化、可以重复使用。但是此法需要 事先用密度梯度法富集细胞，可能造成CTCs细胞 的丢失；各种肿瘤细胞的介电特征大不相同，无 法对所有的肿瘤进行检测。 1.2 特异性富集方法

包括免疫磁珠富集法、CTCs-芯片富集法、纳 米粒富集法等。

免疫磁珠富集法是富集CTCs最常见的方法。 常见的方法有磁性活细胞分选法(magnetic actived cell sorting，MACS)、AdnaTest法、Cellsearch法 等。Cellsearch系统是目前唯一被美国食品与药品 监督管理局(FDA)批准用于转移性乳腺癌、结直 肠癌、前列腺癌的CTCs检测技术^[8]。Cellsearch 系统通过特异性的纳米磁珠富集，选择出了 EpCAM⁺、CK⁺、CD45 −的肿瘤细胞。该技术特 异性、敏感性、重复性较好，可对CTCs进行定 量检测，但是该试剂盒价格昂贵、低产出、低纯 度，还无法在临床上大量推广使用。由于血液中 的CTCs发生了上皮细胞间质转变，而且不是每 种肿瘤细胞都表达上皮标志，比如黑色素瘤细 胞就不表达EpCAM，因而用单一抗原富集CTCs 会造成假阴性结果。研究者们开始尝试加入新 的表面分子。Weissenstein等^[9]用抗EpCAM和抗 CK(CK7/8)免疫磁珠富集CTCs，用酶学反应检测 细胞斑点，有较好的准确性和特异性。OncoCEE 平台运用了EpCAM、N-钙黏蛋白、间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，MSC)、人表皮生长因子 受体2(human epithelial growth factor receptor 2， HER2)、表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)等分子的混合抗体富集转移性乳 腺癌患者的CTCs，与Cellsearch相比，阳性率从 68%提高到89% ^[10]。加入新的检测标志必然会提高 检出率，但是与正常有核细胞的特异性反应和非 特异性反应也会有所增加，所以添加的分子并不 是越多越好，而是需要特异性好、具有一定的代 表性的分子，因此对于检测分子的应用还需要大 量的优化。

最近也有些较新的免疫磁珠法用于CTCs的富 集。Cheng等^[11]运用纳米免疫磁珠结合ELISA的方 法实现了对辅助性T淋巴细胞的检测。其用纳米免 疫磁珠包被的抗CD4抗体对辅助性T细胞进行分 选，再加入辣根过氧化物酶结合的生物素化的抗 CD3抗体，加入底物后检测吸光度。此法可检出稀 少细胞，有希望应用于CTCs的检测。Hossain等^[12] 设计了一种同时检测和杀死CTCs的方法，并模拟 了体内检测CTCs的过程：将等量叶酸结合的纳米 磁珠和铋纳米颗粒加入HeLa细胞中孵育，随后将 孵育后的HeLa细胞注入导管内，模拟体内的血液 流动，导管下方放置一微磁铁将结合了纳米磁珠 的HeLa细胞吸附，导管上方的X射线源将HeLa细 胞上的铋原子激发，被激发的信号强度与HeLa细 胞浓度呈正比，随后增大X射线源的电压和铋原子激发的射线一起协同杀死CTCs细胞。此法可以检 测到约100个CTCs/ml，而且可在检测的同时杀死 CTCs达到治疗效果，无需采集样本，适合床旁检 测，但敏感度仍需要提高。

CTCs-芯片富集法。第一代生物芯片是一种基 于微流体技术的芯片，此芯片可以捕捉未处理的 全血，但是制作复杂、造价昂贵、血流容易发生 阻塞从而影响富集效率，而且利用微流体设计的 细胞分离装置，虽然可以达到较高的纯度和捕获 率，但标本的处理速度低。第二代CTCs芯片又叫 做herringbone(HB)芯片，HB芯片将微芯片镶嵌在 标准载玻片上，对富集的细胞直接进行形态学或 免疫学分析，而且HB芯片可检测癌栓，实现高通 量标本处理^[13]。目前CTCs-芯片技术正朝着功能优 化的方向发展，并且也出现了EpCAM非依赖CTCs 芯片。Sheng等^[14]在HB芯片的技术上优化了其微 混合器的几何结构，将凹槽宽度扩大到120 μm， 凹槽间隙扩大到200 μm，并优化了流速，使得芯 片的捕获效率和纯度均有所增加：分别为＞90% 和＞84%。Karabacak等^[15]设计了一种无需EpCAM 标记的CTCs芯片技术，其运用确定性侧向位移 (deterministic lateral displacement，DLD)技术分离 出单个核细胞，线性排列细胞后，用磁电泳技术 分离CD45和CD66b抗体标记的白细胞和CTCs，达 到富集异质性CTCs细胞群的目的。

纳米粒富集法。应用免疫磁珠进行CTCs富集 时，细胞暴露在磁场中，容易发生聚集，影响细 胞形态和活性，而且被磁珠结合的细胞不易与磁 珠分离，影响后续检测，因而人们开始探寻纳米 粒在CTCs富集中的应用。Sekine等^[16]在氧化铟锡 包被的玻璃电极表面合成了聚3，4-亚乙二氧基噻 吩[poly (3,4-ethylenedioxy) thiophenes，PEDOTs] 纳米颗粒，并将EpCAM连接在纳米颗粒表面，与 光滑的PEDOTs薄膜相比，这种低高宽比的纳米点 捕获效率提高了4~5倍，此法合成简单、高效，在 CTCs检测中有良好的应用前景。除了以上特异性 富集外，还有利用肿瘤细胞和血细胞在粗糙的纳 米材料(如纳米线、纳米柱)表面黏附性不同，对 CTCs进行非特异性富集的纳米检测方法，尽管这 种方法富集效率有所降低，但是可避免细胞表面 特异性抗原丢失所导致的假阴性^[17]。纳米技术还 可以和微流体技术结合来富集CTCs，纳米颗粒增 大表面积有利于CTCs的捕获。该法可以在一定程 度上克服微流体技术处理样本缓慢、单次处理样 本量有限的问题，提高富集效率。Hou等^[18]在硅纳 米柱阵列的纳米位点上包被EpCAM抗体，并设计 了可以使血液标本和流体相混合的通道，组成了 CTCs Nanovelcro芯片，通过控制微流体通道长度 和流体流速等，提高了CTCs捕获敏感度。纳米技 术作为一种新兴CTCs富集技术，发展迅速，具有 较好的应用前景。

CTCs各种富集方法的优缺点见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 CTCs各种富集方法的优缺点 Table 1 Advantages and disadvantages of various methods of CTCs enrichment

表 1 CTCs各种富集方法的优缺点 Table 1 Advantages and disadvantages of various methods of CTCs enrichment

富集后的CTCs细胞可以采用流式细胞仪分 析(flow cytometry，FCM)、免疫细胞化学技术 （immunocytochemistry，ICC）和反转录-聚合 酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)等进行检测。

FCM检测法：FCM是一种对细胞和亚细胞结 构进行检测的技术。目前，有一种活体流式细胞 仪，将荧光标记的单抗注入体内，使用放置在血 管某处的激光检测设备检测流过的CTCs细胞，进 行CTCs计数。该法可检测整个循环系统的CTCs， 标本量的增大弥补了检测敏感度的不足，是一种 微创体内诊断技术。

ICC检测法：ICC是用能与显色剂结合的单抗 与CTCs特异性结合后，通过显色剂显色从而对 CTCs进行鉴定的技术。目前运用最多的单抗是各 种抗CK抗体，单细胞水平上的多种抗体染色是一 种趋势，如上皮细胞表面标志(EpCAM、CK)、 间质细胞表面标志[(Snail1、Slug、锌指E-盒结合 同源异形盒1(zinc-finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)、锌指E-盒结合同源异形盒2(zinc-finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)、E47、Twist， 抑制上皮型钙黏素 (E-Cadherin)等]^[19]、干细胞标 志[CD133+、CD44+、CD24-/low、乙醛脱氢酶 1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH 1)和腺苷三磷 酸结合盒转运体G2(ATP-binding cassette sub family G member 2，ABCG2)等]^[20] 、特殊标志[HER-2、 survivin、雌激素受体(estrogen receptor,ER)和孕激 素受体(progesterone receptor,PR)等]^[21,22]。

qRT-PCR检测法：此法敏感度高，但是坏死 的癌细胞、上皮细胞污染等都可以造成假阳性结 果，此法无法检测CTCs细胞形态，在临床应用上 仍有局限性。 3 CTCs检测的临床意义

肿瘤的转移和复发往往是导致死亡的主要原 因。CTCs计数是预测临床预后、化疗疗效的有力 指标。对于Cellsearch方法来说，乳腺癌和前列腺 癌CTCs计数≥5或结直肠癌计数≥3时，提示预后 不良。单周治疗前后CTCs计数持续≥5的患者， 预示治疗抵抗。也有学者认为CTCs计数增高或 不变提示治疗无效。同时，CTCs表面分子的检 测可为治疗提供有效信息。CTCs上HER-2的表达 可指导乳腺癌患者服用曲妥珠单抗，雌激素受体 (estrogen receptor,ER)和孕激素受体(progesterone r eceptor,PR)表达可指导乳腺癌患者内分泌治 疗。另外还有些指标尚处于研究之中，如指示 曲妥珠单抗治疗抵抗的指标有：EGFR、磷酸化 EGFR(phosphorylated EGFR,pEGFR)、PI3K、磷酸 化PI3K(phosphorylated PI3k,pPI3K)、Akt、磷酸化 Akt(phosphorylated Akt,pAkt)等；指示DNA损伤的 标志有：核苷酸切除修复交叉互补蛋白1(excision repair cross-complementing protein1,ERCC1)、 γ-H2AX、M30等。CTC检测有望提供“液体活 检”，实时、多次、非侵入性地为疾病治疗提供 有效信息。 4 展望

CTCs富集与检测技术发展迅速，新方法不断 涌现，这些新方法不乏敏感度、特异性较好的， 但是仍需要建立规范的实验流程和制定相应的标 准，同时还需要大量的临床试验，保证实验的重 复性，且和通过FDA认证的Cellsearch法相比， 要存在一定的优势才能在临床应用上占据一席之 地。各种方法的联合应用可以提高敏感度和特异 性，可能是将来检测CTCs的一个趋势。

由于单细胞分子检测技术已建立，细胞发生 间质样改变后的相关分子、循环肿瘤干细胞分子 以及治疗性相关分子会是将来研究的重点，尤其 是治疗性相关分子的研究尚处于起步状态，还需 要进行大量的实验。

CTCs检测必然会对临床肿瘤的诊断、个体化 治疗、预后产生的影响，研究者们仍需要继续完善 CTCs富集与检测方法以利于其在临床中的应用^[23]。