质谱（mass spectrometry，MS）是一种通过检 测待测物离子的特异质荷比来分析被测物质的方 法，具有敏感度高、特异性好、分析方式灵活等优 点，能够实现在体、实时、在线、高通量的测试和 分析；特别是近年来迅速发展的复杂基体的常压直 接质谱分析技术(ambient mass spectrometry,AMS) 和质谱成像技术(mass spectrometry imaging,MSI)， 使质谱的应用领域更加广泛^[1]。肺癌是最常见的恶 性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤榜 首^[2]，其主要原因在于临床诊治的患者大多数处在 中晚期。而已有研究表明，ⅠA期肺癌的五年生存 率（73%）明显高于Ⅳ期（13%）^[3]。因此，很多旨 在提高肺癌预后的研究都集中在肺癌的早期诊断方面。然而，低剂量计算机断层扫描（LDCT）、 痰液细胞学检查、支气管镜检查等用于肺癌筛查的 临床试验结果显示肺癌的预后并没有得到改善^[4]。 因此，专注于肺癌分子标志物的研究备受关注。 本文就质谱分析及其在肺癌分子标志物研究中的 应用作一综述。 1 质谱分析技术

质谱分析技术体系主要由样品处理与离子 源、质量分析器、离子检测器、数据处理与显示 系统等部分组成，是基于分子及亚分子水平的检 测分析技术，依赖于被测样品中物质分子的离子 化而实现物质的检测，可以获得被分析物的分子 尺度信息，在物质鉴定中具有独特的优势。自 1906年Thomson发明质谱以来，质谱分析技术得到 了飞速的发展，并取得了四次诺贝尔奖的荣誉。 近年来，AMS和MSI是质谱分析技术迅速发展的 两个重要方面，它们在生物质谱分析中具有广阔 的应用前景。 1.1 常压直接质谱分析技术(AMS)

质谱分析技术依赖于离子的形成，中性分子 在转变成离子后才能被检测；但不同物质分子具有不同的化学性质，被电离形成离子的难易程 度也不一；而且有些样品成分复杂多样，电离 出目标分子也就需要质谱离子化技术达到更高的 要求。然而，传统的离子化技术如电喷雾电离 （ESI）、大气压化学电离（APCI）等都是封闭式 电离源，被测样品往往需要封闭在一定的管道或 真空环境中，而且被测样品需要经过复杂的预处 理过程才能用于分析，导致分析效率低下。为了 适应常压下复杂基体样品的质谱分析和提高质谱 分析效率，AMS应运而生。

2004年Cooks教授研究组研发的电喷雾解吸 电离（DESI）技术^[5]，揭开了常压下无需样品预 处理的AMS的序幕，促进了直接离子化技术的发 展。在随后的数年间，各式各样的AMS离子源被 研制出来，如电喷雾萃取电离（EESI）、表面解 吸常压化学电离（DAPCI）、介质阻挡放电电离 （DBDI）、低温等离子体（LTP）探针和电喷雾 辅助激光解吸电离（ELDI）等 ^[6]。2007年Chen等^[7] 首次提出中性解吸电喷雾萃取电离（ND-EESI）技 术，可用于各种黏性样品（痰液、牙膏、化妆品、 食用油等）以及固体表面等的直接分析。Hiraoka 等^[8]采用探针电喷雾电离（PESI）技术直接分析生 物样品，包括液态样品成分和湿润固体样品表面物 质分析等。随着这些关键技术的发展，越来越多的 复杂临床样品也可以通过质谱进行检测和研究。

然而，AMS在无需样品预处理的条件下直 接分析各种复杂样品的同时也带来了复杂庞大的 质谱数据。在这种情况下，很多时候无法再简 单的凭观察、分析谱图来解析数据，往往需要 更为复杂多元的数据处理策略，如主成分分析 （PCA）、偏最小二乘（PLS）、人工神经网络 （ANN）等分析方法。例如，Jia等^[9]应用PCA区 分了不同肾结石样品的表面解吸化学电离质谱 (DAPCI-MS)数据；Dill等^[10]采用PLS区分了11例肾 癌患者的癌组织与癌旁组织的电喷雾解吸电离质 谱（DESI-MS）数据，并将乳头状肾癌和透明细 胞肾癌区分开。可以说，数据分析是AMS发展的 重要基础之一。 1.2 质谱成像技术(MSI)

MSI是根据特定质荷比的物质在样品中的分 布或浓度差别而形成影像的一种分子成像技术， 可以在不对待测物进行标记的情况下以被分析 物最初的形态展现出该质荷比物质在被分析物中 的空间分布特征。基于MALDI、ELDI和DESI等 的MSI技术已成为脂类分布、药物代谢和肿瘤标 志物等领域的重要研究工具^[11]。其中，MALDIMSI[1 2 - 1 3]已用于组织切片中的蛋白、多肽、脂 类、药物以及代谢物等的成像分析，是临床蛋白 质组学，尤其是肿瘤蛋白质组学研究的重要分 析工具。而随着直接离子化技术的发展，DESIMSI ^[14]、PESI-MSI ^[15]等直接质谱分析技术也已应 用于生物组织的成像分析。可以预见，MSI在肿瘤 的标志物、分类、早期诊断及预后评价等研究中 都将发挥重要作用。

除了AMS和MSI的迅速发展，质谱仪器也在 不断的发展和改进，传统大型质谱仪的灵敏度、 分辨率、分析速度等性能在不断提高^[16]。同时， 为了避免传统质谱仪结构复杂、体积厐大、价格 昂贵、不便携等诸多缺点，也有研究专注于研制 体积小、质量轻、功耗低、便于携带、可以在现 场进行原位无损检测的便携式质谱仪^[17,18]。 2 肺癌分子标志物的质谱分析研究

肺癌发生是多因素多步骤的发展过程，在发 生细胞形态学改变（如异型细胞）前，已伴随着 亚细胞层次的改变（如线粒体、溶酶体等），而 在细胞和亚细胞层次改变之前发生的是分子水平 的改变。这些改变可以表现为呼出气体、痰液、 肺组织、血液等的成分变化。质谱分析具有灵敏 度高等特点，可用于检测肺癌相关样品中的代谢 变化，已有不少学者将质谱分析用于肺癌的分子 标记物的研究。以下就呼出气体、痰液、肺组织 及血清等样品中肺癌分子标志物的质谱分析展开 讨论。 2.1 呼出气体

人呼出气体含有水、二氧化碳、氮气、氧 气、惰性气体及痕量的挥发性有机化合物(volatile organic compounds，VOCs)等；其中VOCs的种类 多达200多种，可由体内细胞生化反应产生，也 可自外界环境经肺和皮肤吸收入体内^[19]。呼出气 体中有多种VOCs可被检测，包括饱和和不饱和 的碳氢化合物、含氧、含硫和含氮的有机化合物 等，而且在不同生理、病理状态下可有特征性的 VOCs ^[19]。因此，检测VOCs可为追踪体内的代谢 变化提供一个窗口，肺癌呼出气体标志物研究或 可为肺癌无创、快速诊断及发病机制等研究提供 新的思路。

气相色谱质谱联用法（GCMS）是目前用于 呼出气体研究的主要质谱分析方法，可以检测分 析呼出气体中痕量的VOCs。1985年Gordon等^[20]采用一套特制的气体收集装置收集呼出气体，利 用GCMS检测12例肺癌患者和17例健康者的呼出 气体，确定了28种肺癌患者呼吸气体中的特征性 VOCs，首次提出将呼出气体中VOCs的检测用于 肺癌诊断。Wang等^[21]利用固相微萃取与GCMS 联用分析了88例肺癌患者的呼出气体，同时采用 线性判别建立肺癌诊断模型，最后发现利用23种 VOCs建立的肺癌诊断模型可以达到96.47%的敏 感度和97.47%的特异性，但该诊断模型不能明显 区分早期和晚期肺癌。Montuschi等^[22]利用GCMS 结合模式识别算法设计出一种手持便携式的“电子 鼻”，用于快速检测哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺 癌等呼吸系统疾病的“呼气纹”（breathprints）。但 由于这些研究样本量过小，GCMS还没有成为肺癌 的临床诊断方法。除了GCMS外，其他质谱方法也 可用于呼出气体的分析，Rutter等^[23]报道采用选择 离子流动管质谱（SIFT-MS）检测到肺癌患者的呼 出气体中乙醛含量升高，Ding等^[24]利用EESI-MS对 人体呼出气体进行了实时活体分析。但这些方法 均没有深入探讨VOCs的产生机制，它们的效果仍 需要更多的研究来证实。 2.2 痰液

痰液是气管、支气管、肺泡所产生的分泌 物，含有中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸细胞等炎 性细胞，坏死上皮碎片以及白蛋白、Na⁺等分子或 离子成分。不同疾病状态下痰液可发生相应的变 化，在细胞种类、代谢成分以及黏稠度等方面均 发生改变，如肺炎患者痰液可变黄浓而黏稠，肺 癌患者痰液中可在显微镜下观察到异型细胞等。 因此，痰液含有丰富的病理生理信息，可作为肺 癌和其他肺病患者特有的样品。然而，正常情况 下，痰液的分泌量很少，而且容易受唾液的污染 或口咽疾病的影响。因而痰液标本的收集是影响 肺癌痰液标志物研究的关键技术之一。目前普 遍应用的是诱导痰技术^[25]，该技术的患者依从性 好、无创、安全、可靠、具可重复性，能够保证 在痰液量较少的情况下仍能获得足量、合格的痰 液样本。

目前痰液的质谱检测分析报道较少，且主要 是GCMS用于检测分析肺结核患者痰液的，肺癌 患者痰液的质谱研究则报道更少。Xiao等^[26]利用 二维凝胶电泳与质谱联用分析了72例肺癌患者和 16例正常人的痰液，发现肺癌患者痰液中存在特 异性的蛋白质表达。本课题组前期研究^[27]对常压 直接质谱分析技术在肺癌患者痰液分析中的应用 进行了探索。在研究中我们利用自主研制的NDEESI-MS对8例非小细胞肺癌患者和8例非肺癌患 者的痰液样品进行了快速质谱分析，质谱数据采 用主成分分析（PCA）方法分析，发现非小细胞 肺癌组与非肺癌患者组的痰液质谱数据能够将两 组患者较好地区分开，并且两组样品的质谱指纹 图在质荷比为78、87、99、118、362、367、539 等峰的相对丰度均有明显差异。由此可见，质谱 分析技术对痰液快速、无创诊断肺癌具有潜在的 应用价值。但该研究纳入的样品数过小，而且没 有深入研究这些差异的质谱峰的具体物质及产生 机制，质谱分析技术用于痰液肺癌标志物研究仍 需要更多的探索。 2.3 肺组织

肺癌组织是病理生理信息最为丰富的肺癌研 究材料，理论上肺癌引起的分子、细胞及组织的 改变最早见于肺组织内，各种肺癌标志物在体内 的分布也以肺癌组织中含量最高。关于肺癌组织 中的肺癌标志物的研究报道也相对较多，如肺 癌组织中微小核糖核酸（Micro-RNA）、蛋白表 达、启动子甲基化等^[4]。自从生物质谱发展以来， 质谱分析技术就已用于肺癌组织的标志物研究， 并随着质谱方法的改进而不断发展。早期的组织 标志物质谱研究多需要其他样品处理技术与质谱 分析技术联用，如色谱、电泳、萃取等样品分离 和提纯技术。Oh等^[28]报道他们利用二维凝胶电泳-质谱联用技术建立了1 000余例肺癌组织蛋白表达 数据库，并尝试用这种方式建立全新的肺癌分类 方式及早期诊断方法。Rahman等^[29]采用MALDITOF MS分析了来自53名肺癌患者的25例正常肺组 织、29例支气管上皮组织、20例癌前病变组织和 36例侵袭性肺癌组织，发现这些病变有特定的蛋 白表达模式，并且该模式能够以90%准确度区分正 常肺、癌前病变肺和侵袭性肺癌组织。

近年来，随着质谱分析技术及其联用技术如 电泳、色谱、萃取等技术的发展，肺癌组织标志 物的质谱研究也在不断地改进，有研究者将这些 技术与分子生物学技术如免疫蛋白印记（Western blot）、PCR分析等联用。Li等^[30]将二维聚丙烯 酰胺凝胶电泳、Image Master 2D Platinum软件与 MALDI-TOF MS联用用于分析肺癌组织和癌旁组 织的膜蛋白表达差异，发现12种蛋白质在癌组织 中表达上调，7种蛋白在癌组织中表达下调；其 中，各有一种上调和下调的蛋白质通过Western blot和PCR技术得到了印证。除了蛋白表达谱的差异外，也有质谱研究发现脂质代谢也在肺癌组织中 表现出明显的差异。Lee等^[31]采用MALDI-MS技术 分析了21例非小细胞肺癌患者的肺癌组织和癌旁 正常肺组织，发现卵磷脂（PC34:1）在肺癌组织中 过表达，而且肺鳞癌和肺腺癌存在不同的磷脂质表 达谱；他们还将这些研究结果与病理切片进行对 比，发现磷脂质表达谱能够达到92.9%准确度。 2.4 血清

肿瘤细胞分泌的特异性物质可以通过各种方 式进入血液循环，进而通过血液分析可达到指导 肿瘤诊断的目的，这种血液中的特异物质便是肿 瘤的血液标志物，如甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原 （CEA）等。肺癌已有多种血液标志物得到了广 泛的研究，包括CEA、糖类抗原-125（CA125）和 神经元特异性烯醇化酶（NSE）等^[32]。这些肺癌标 志物对肺癌的临床诊断、病情进展、治疗方案、 疗效及预后判定等方面均有重要的指导意义。然 而，这些标志物在特异度和灵敏度方面仍然不能 让人满意，且它们往往在晚期肺癌患者的血液才 得以检出，故并不适于肺癌的早期诊断和筛查。

血液作为一种相对易于获得的样品，较早用 于肺癌标志物的质谱分析研究中。Huang等^[33]利用 液相色谱-串联质谱联用技术对比分析37例非小细 胞肺癌患者放化疗前后的血清蛋白表达情况，并 根据放化疗敏感性将患者分为两组，发现α-抗胰蛋 白酶等蛋白在放化疗敏感组和抵抗组间的表达存 在明显差异（P<0.05），说明通过质谱蛋白组学 方法或可找到判定放化疗预后的肺癌标志物。Guo 等^[34]采用傅立叶离子回旋共振质谱分析技术分析 58例肺癌患者和495例健康人的血清，质谱数据采 用单因素和偏最小二乘分析，发现有多达141种血 液代谢物在肺癌患者和正常人间存在显著差别， 并且得到的结果显示鞘磷脂、溶血卵磷脂等脂质 衍生物与肺癌的进展有关联。由此可见，肺癌患 者血清中存在与肺癌发生、发展相关的代谢改 变，通过质谱方法可检测和分析这些代谢改变， 对血液中肺癌分子标志物研究及肺癌发病机制、 早期诊断等研究具有重要意义。 3 小结与展望

质谱分析技术是发展非常迅速的现代分析测 试方法，具有高的敏感度和特异性，可与不同的 样品分离纯化技术联用，也可利用各种直接离子 化源进行测试分析，还可在线、离体或原位、高 通量检测分析各种状态的样品。肺癌是最常见的 恶性肿瘤之一，其临床诊治现状不容乐观，可通 过早期诊断、早期治疗和提高临床治疗手段等改 善这一现状。多个临床试验研究显示低剂量CT、 痰液细胞学检查等没有提高肺癌的预后，因而探 索肺癌的分子标志物具有非常重要的意义。质谱 分析在肺癌分子标志物研究方面具有广泛应用， 可分析包括肺组织、痰液、呼出气体、血清等不 同状态的样品，其研究成果可为改善肺癌的诊治 现状提供重要的指导意义。