胰腺癌是恶性肿瘤中死亡率最高的一种，其 五年生存率仅4%，其发病机制未完全明了。肿 瘤的形成涉及肿瘤细胞的增殖、分化及细胞外基 质自然屏障的破坏等有关，其中表皮生长因子 （EGFR）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）在肿 瘤发生、发展过程中起重要作用^[1,2,3,4]。本研究检测 EGFR、MMP-9在胰腺癌组织中的表达，探讨它们 与胰腺癌临床病理特征和预后的关系。 1 资料和方法 1.1 临床资料

收集2006年2月至20012年8月间武汉市中心医 院肝胆胰外科经手术及病理证实的44例胰腺癌标 本，其中男25例，女19例，患者年龄为42~78岁， 平均(62.1±7.9)岁。分期标准根据2002年美国癌症 联合研究会（AJCC）制定的TNM分期：Ⅰ~Ⅱ期 21例，Ⅲ~Ⅳ期23例。肿瘤部位：胰头部24例， 胰体尾部20例。淋巴结阳性19例，淋巴结阴性25 例。组织学分级：高分化腺癌15例，中分化腺癌 22例，低分化腺癌7例。以同期病理证实的13例慢 性胰腺炎和7例正常胰腺组织标本作为对照。 1.2 免疫组织化学染色

使用即用型免疫组化检测试剂盒(武汉博士德 生物工程有限公司)检测EGFR、MMP-9的表达， 按照试剂盒说明书操作。抗EGFR、MMP-9一抗购 自武汉博士德生物工程有限公司。胰腺癌组织均 经中性福尔马林固定，梯度乙醇溶液脱水，二甲 苯透明，石蜡包埋，制成蜡块。连续切片每张厚 度4~6 μm，免疫组织化学法染色采用SP二步法进 行，具体操作参照说明书。MMP-9采用高温高压 柠檬酸修复，EGFR用胃蛋白酶修复，最后用DAB 显色。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性 对照，已知阳性切片为阳性对照。在光学显微镜 下结合HE切片观察免疫组织化学切片的显色反 应。结果判定采用双盲法，每组均设有阳性和阴 性对照。每张切片随机选取10个高倍视野，每个 视野计数100个肿瘤细胞，计算阳性细胞数的平均 百分比：5%~25%为1分；＞25%~50%为2分；＞ 50%~75%为3分；＞75%为4分。染色强度分为： 淡黄色为1分；黄或深黄色为2分；褐或棕褐色为 3分。两者计分相乘大于1为阳性。EGFR阳性染 色为淡黄色、棕黄色或棕褐色，定位于细胞质和 （或）细胞膜，MMP-9阳性染色为胞质内染成淡 黄色至棕褐色。 1.3 统计学方法

应用SPSS 18.0统计软件包处理数据，采用χ²检验和配对资料的Spearman等级相关分析法。P ＜0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 EGFR和MMP-9在各胰腺组织中的表达

7例正常胰腺组织中均无EGFR及MMP-9的 表达，13例慢性胰腺炎组织中EGFR、MMP-9阳 性表达率分别为23.1%(3/13)和15.4%(2/13)。胰 腺癌组织中EGFR、MMP-9的阳性表达率分别为 61.4%(27/44)和54.5%(24/44)；相应癌旁组织的阳 性表达率分别为34.1%(15/44)和29.5%(13/44) ，见 图 1。胰腺癌组织中的EGFR及MMP-9阳性表达率 均显著高于相应癌旁组织(P<0.05)。且胰腺癌组织 及癌旁组织中EGFR及MMP-9的表达均显著高于慢 性胰腺炎组织和正常胰腺组织(P值均<0.05)。

A,B:the positive EGFR expression was detected in the plasmalemma of pancreatic carcinoma(A) and adjacent tissues(B); C,D:the positive MMP-9 expression was detected in the cytoplasm of pancreatic carcinoma(C)and adjacent tissues(D) 图1 胰腺癌及癌旁组织中EGFR和MMP-9的表达(SP ×200) Figure 1 Expression of EGFR and MMP-9 in pancreatic carcinoma and adjacent tissues(SP ×200)

胰腺癌组织中EGFR和MMP-9的表达与患者性 别、年龄及肿瘤部位、大小均无关，而与肿瘤的 血管侵犯、淋巴结转移、分化程度、分期有关(P 值均<0.05)，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 EGFR、MMP-9的表达与胰腺癌临床病理特征的关系 Table 1 Relationship between EGFR, MMP-9 expression and clinicopathologic parameters of pancreatic carcinoma

表 1 EGFR、MMP-9的表达与胰腺癌临床病理特征的关系 Table 1 Relationship between EGFR, MMP-9 expression and clinicopathologic parameters of pancreatic carcinoma

EGFR阳性表达率高的病例组MMP-9的阳性 率也高，反之亦然。配对资料的Spearman相关 分析显示，EGFR表达与MMP- 9表达呈正相关 （r=0.307,P<0.05)。 3 讨论

EGFR家族属于酪氨酸激酶受体大家族，是原 癌基因（c-erbB-1）的表达产物，作为一种跨膜糖 蛋白，当配体结合于受体的胞外区后，引起受体 胞内区自身磷酸化并激活胞内酪氨酸激酶，当配体与细胞表面的受体结合后，激活其下游信号通 路进而刺激肿瘤的转化、增殖和转移以及血管发 生等^[5]。EGFR在许多肿瘤过表达或突变，导致肿 瘤细胞生长失控和恶性程度增高，EGFR在乳腺 癌、小细胞性肺癌、胆囊癌等多种肿瘤中存在过 表达^[6,7,8]。陈卫国等^[9]发现通过小干扰RNA靶向抑制 EGFR能够有效抑制前列腺癌的生长。有研究表明 单独或联合应用一些阻滞EGFR信号转导通路的药 物，可以明显抑制胰腺癌细胞的迁移和浸润^[10,11]。 本实验中检测了44例胰腺癌组织及其对应癌旁组 织中EGFR蛋白的表达情况，胰腺癌中EGFR的表 达率为61.4%，表达高于配对癌旁组织、慢性胰 腺炎组织及正常胰腺组织的表达 (P<0.05)，说明 EGFR信号通路在胰腺癌组织中呈活化状态。

MMPs是一组依赖于锌离子的能降解细胞外 基质的内肽酶家族，其主要作用是降解基质中的 蛋白，MMP-9是其家族中的一员^[12]。MMP-9属 于Ⅳ型胶原降解酶，是降解细胞外基质的主要酶 类之一，Ⅳ型胶原酶通过对基膜中Ⅳ型胶原与层 黏连蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖等物质的降 解，使这些屏障消失，从而促进肿瘤对周围组织 的侵袭^[13]。Fujisawa等^[4]在胰腺癌的小鼠模型中 发现巯乙胺通过下调MMP-9等基质金属蛋白酶的 表达能够抑制肿瘤的侵袭、迁移，并增加胰腺癌 小鼠的存活率。本实验中检测了44例胰腺癌组织 及其对应癌旁组织中MMP-9的表达情况，胰腺癌 中MMP-9的表达率为54.5%，明显高于配对癌旁 组织、慢性胰腺炎组织及正常胰腺组织中的表达 (P<0.05)，说明MMP-9可能与胰腺癌的发生发展有 关。

本研究结果表明，EGFR和MMP-9蛋白表达 与患者性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤部位等病理 因素均无明显相关，而与血管侵犯、淋巴结转移 状况和肿瘤TNM分期有关。肠系膜上血管和淋 巴结转移阳性、分化程度较低和分期较晚的病例 组，EGFR和MMP-9蛋白表达阳性率显著升高， 差异有统计学意义。Spearman相关分析显示， EGFR和MMP-9蛋白表达呈正相关，说明MMP-9 和EGFR蛋白信号通路之间存在一定联系，其作用 机制尚未明了。Lue等^[14]研究发现MMP-9可能参与 激活EGFR信号途径，在前列腺癌细胞上皮-间质 转化过程中增加锌离子运载体LIV-1的表达增强了 肿瘤细胞的迁移侵袭和转移能力，LIV-1的表达活 了化EGFR-ERK信号途径。LIV-1诱导MMP-9等表 达的上调，而MMP-9等可以使膜结合的HB-EGF 分离出来，HB-EGF作为EGFR上游因子从细胞表 面释放，可溶性的HB-EGF引起EGFR的磷酸化和 其下游的ERK信号途径的活化。因此，MMP-9可能参与释放EGFR上游信号因子过程，进而启动 EGFR信号通路，促进胰腺癌的发生发展。淋巴 结转移和肿瘤分期是判断肿瘤患者预后的重要指 标，本研究结果再次证明淋巴结转移和TNM分期 在判断胰腺癌预后方面起到不可替代的作用。不 同的患者即使处于同一分期或同一状态，其预后 依然存在差异，分子生物学标志物目前已成为判 断胰腺癌预后的重要指标。本研究表明，EGFR和 MMP-9蛋白在胰腺癌组织中均呈高表达，两者与 胰腺癌的发生密切相关，联合检测EGFR和MMP-9 表达，更能准确反映胰腺癌的生物学特性。EGFR 和MMP-9蛋白可以作为胰腺癌诊断和预后判断的 分子标志物，因此在胰腺癌的防治中可能有良好 的应用前景。