宫颈癌的发生是一个多因素、多步骤的过 程，由正常宫颈上皮向宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN），即癌前病变转化， 再发展为浸润性宫颈癌，约需要十年时间，仅有部 分上皮内瘤变最终发展为宫颈癌，因而，寻找能预 测宫颈病变发展的标志物尤为重要。持续性高危 型HPV感染是宫颈癌发生的必要条件，然而有证 据显示单一的HPV感染不足以导致宫颈癌，宿主 的基因变异在宫颈癌的发展中也起了重要作用,明 确这些遗传的改变对于宫颈癌的筛查和治疗有重 要的意义^[1]。miRNA是一类长约19～25个核糖核苷 酸的非编码调控单链小分子RNA。研究已经显示 成千上万的蛋白编码的基因共同由miRNA调节^[2]。 miRNA表达异常与多种肿瘤相关，其在肿瘤的发 生过程中发挥癌基因或抑癌基因的作用。已有研究 发现miRNA在宫颈癌中有异常表达，而在癌前病 变中的研究不多，研究结果也不一致。本研究采用 miRNA芯片技术筛选宫颈癌、癌前病变及正常宫 颈组织差异表达的miRNA，探讨miRNA与宫颈癌 的关系，以期为宫颈癌的筛查提供生物标志物，为 阐明宫颈癌发生的分子机制提供新的依据。 1 资料和方法 1.1 标本资料

宫颈石蜡组织标本来自广西壮族自治区人民 医院病理科。12份标本用于miRNA芯片检测，其 中3份为宫颈鳞状细胞癌(SCC)，3份为宫颈高度鳞 状上皮内病变（HSIL）（CIN2/CIN3），3份为宫 颈低度鳞状上皮内病变（LSIL）(CIN1)及3份正常 宫颈组织；60份标本用作miRNA表达的验证，包 括20份宫颈癌、20份HSIL、10份LSIL组织及10份 正常宫颈组织。标本均由病理科医生复核。所有 的宫颈癌患者在术前均未接受过放化疗及其他治 疗，正常宫颈组织来自因子宫良性病变切除的子 宫。该研究已获得医院伦理委员会同意。 1.2 miRNA芯片检测 1.2.1 RNA抽提和纯化

选取宫颈石蜡切片中 病变部分的组织，使病变组织达90%以上，采用 RecoverAllTM 总核酸提取试剂盒 (美国Ambion公 司)根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的总 RNA抽提，抽提所得总RNA经安捷伦2100生物分析 仪 (美国安捷伦科技公司)电泳质检合格后备用。 1.2.2 芯片实验

miRNA芯片杂交所用芯片为安 捷伦人miRNA芯片(8×15K) V12.0芯片(覆盖866个 人类相关miRNA以及89个人类病毒相关miRNA)。 芯片杂交实验及后续结果分析在上海伯豪芯片生 物技术有限公司完成。实验样品RNA采用Agilent miRNA芯片配套的试剂盒(美国安捷伦科技公司)， 按照标准操作流程对样品中的miRNA分子进行荧 光标记及样品的杂交实验。芯片结果采用安捷伦 微阵列芯片扫描仪进行扫描，用Feature Extraction 软件10.7读取数据，最后采用Gene Spring软件 11.0进行归一化处理。 1.3 实时定量PCR (real-time RT-PCR)验证 1.3.1 石蜡组织总RNA抽提及反转录

石蜡切片 用二甲苯脱蜡，用QuantoBio总RNA提取试剂盒进 行总RNA抽提；用加尾法进行cDNA第一条链的合 成。借助E.coli聚合酶添加PolyA尾至总RNA，利 用QuantoBio反转录系统将加PolyA尾的总RNA逆 转录成加PolyA尾的cDNA。 1.3.2 Real-time PCR

以第一链cDNA为模板，利 用SYBR Green PCR Master Mix进行PCR扩增,反应 在20 μl的体系中进行。采用溶解曲线分析和凝胶 电泳实验来检测real-time RT-PCR产物的特异性。 U6 snRNA作为实验的内参基因。miRNA相对表达 量为2^-ΔΔCt，ΔCt=(Ct_miRNA-Ct_U6)。 1.4 靶基因的预测及功能分析

利用生物信息学方法，通过miRNA 靶标预测 工具（TargetScan、PicTar、miRanda等）对在宫颈 癌组织中明显下调的miR-218及明显上调的miR-21 的靶基因进行预测,取至少被3个软件同时预测的基 因作为靶基因。采用Gene Ontology数据库(http:// www.geneontology.org)对靶基因进行功能分析。 1.5 统计学方法

利用基因芯片显著性分析（SAM）和t检验 （t-test）进行差异表达基因分析，差异倍数为2倍 及以上(即≥2或≤0.5)，Q-value (错误发现率)<5% 的miRNA为有差异的miRNA。应用SPSS软件对 PCR结果进行统计分析，组间miRNA表达水平比 较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 miRNA芯片检测结果 2.1.1 宫颈癌组织中差异表达的miRNA

利用宫 颈SCC、HSIL、LSIL组织和正常宫颈组织进行 miRNAs芯片分析，聚类分析结果显示在不同的 宫颈组织中存在差异表达的miRNA。与正常宫颈 组织比较，宫颈癌组织中有15个miRNAs表达为 上调(>2倍)，10个miRNAs表达为下调(<0.5倍)， 其中上调4倍以上的miRNA有miR-21及miR-21* 、 miR-15b、miR-16，下调4倍以上的有miR-218及 miR-376，其中上调最明显的是miR-21，下调最明 显的是miR-218，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 宫颈癌和正常宫颈组织中差异性表达的miRNA Table 1 Differential expression of miRNAs in cervical cancer and normal tissues Notes: 1: mean fold changes of miRNA expressions in cervical cancer tissues compared with those in normal cervical tissues;2: the lowest false discovery rate of differential expression with statistically significance

表 1 宫颈癌和正常宫颈组织中差异性表达的miRNA Table 1 Differential expression of miRNAs in cervical cancer and normal tissues

芯片分析结果显示，与正常宫颈组织比较，HSIL中 有13个miRNA表达为上调，31个miRNA表达为下 调，其中上调4倍以上的有miR-663、miR-188-5p 、 miR-765、miR-1300、miR-483-5p，下调4倍以上 的有miR-218、miR-376c、 miR-374b、miR-149、 miR-152、miR-142-3，见表 2。LSIL与正常宫颈组 织比较，仅miR-1260表现为2倍的下调（0.441倍， P＝0.008），其他miRNA未显示出差异性表达。

表 2(Table 2)

表 2 宫颈高度鳞状上皮内病变和正常宫颈组织中差异表达的miRNA Table 2 Differential expression of miRNAs in HSIL and normal tissues Notes: HSIL: high-grade squamous intraepithelial lesion;1: mean fold changes of miRNA expressions in HSIL tissues compared to those in normal cervical tissues;2: the lowest false discovery rate of differential expression with statistically significance

表 2 宫颈高度鳞状上皮内病变和正常宫颈组织中差异表达的miRNA Table 2 Differential expression of miRNAs in HSIL and normal tissues

从miRNA芯片检测结果中选取在宫颈癌组织 中有异常表达的4个miRNA，利用荧光定量RTPCR在20份宫颈癌、20份HSIL、10份LSIL及10份 正常宫颈组织中进行验证。这4个miRNA分别为 miR-21、miR-218、 miR-31、miR-376a，U6作为 内参照并进行标准化。结果显示与正常宫颈组织 比较，miR-218在宫颈癌及HSIL中均显示明显下降 （P＝0.000、P<0.05），miR-21、miR-31表达在 宫颈癌组织中明显增加（P <0.00）；芯片检测结 果显示miR-376a在宫颈癌及HSIL中均为下降（P <0.01），而PCR检测在HSIL中未显示出明显的下 调(P >0.05)，见图 1。这4个miRNA经real-time RTPCR验证，显示与miRNA芯片基本一致的变化。

图1 Microarray和Real-time PT-PCR检测4个miRNAs在宫颈癌及癌前病变组织中相对表达结果比较 Figure 1 Relative expressions of four miRNAs in cervical cancer and cervical precancerous lesions detected by realtime RT-PCR and microarray assay

经miRNA 靶标预测工具预测，miR-218预测的靶基因有2 886个，其中LAMB3（层黏连蛋白β3） 和ROBO1（迂回的轴突引导受体1）已在一些肿 瘤中证实为miR-218的靶基因。miR-21预测的靶基 因有29 329，其中PDCD4（程序性细胞死亡蛋白 4），PTEN (磷酸酶张力蛋白)在一些肿瘤中得到验 证。利用GO数据库对这几个靶基因进行功能分析, 结果显示miR-218的靶基因LAMB3和ROBO1与细 胞的黏附和迁移有关，miR-21的靶基因PDCD4和 PTEN与细胞的增殖、迁移和凋亡有关，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 miR-218和miR-21靶基因的GO分析 Table 3 Gene ontology annotation of target genes of miR-218 and miR-21

表 3 miR-218和miR-21靶基因的GO分析 Table 3 Gene ontology annotation of target genes of miR-218 and miR-21

目前，已有研究显示miRNA在宫颈癌组织中 有差异性表达。Lee等^[3]利用实时定量PCR比较10 例正常宫颈和10例宫颈鳞状细胞癌组织的miRNA 谱的变化,发现70个miRNA的表达有明显的改变， 其中68个上调，仅有2个下调。Rao等^[4]利用芯片 技术分析了13例宫颈癌及癌旁正常组织的miRNA 的表达，发现在宫颈癌组织中18个miRNA表达升 高，而19个miRNA表达下降。Huang等^[5]研究显示 宫颈癌组织中7个miRNA表现为明显降调节，并与 淋巴结转移和预后有关。在本研究中，我们利用 microRNA芯片对宫颈癌、HSIL、LSIL和正常宫颈 组织进行筛查，结果显示宫颈癌中15个miRNA表 达上调，10个miRNA表达下调，其中上调最明显 的是miR-21，下调最明显的是miR-218。利用realtime RT-PCR对其中有异常表达的4个miRNA进行验证，显示出基本一致的结果。这些研究结果显 示，宫颈癌组织中存在miRNA的异常表达，这些 差异表达的miRNA可能参与了宫颈癌的发生。然 而，不同的研究显示差异表达的miRNA不一致，甚 至相反，这些不一致的结果可能是由于高通量平台 的差异、不同实验室采用的实验方法不同以及人群 遗传变异体的不同造成^[6]。miRNA在用甲醛固定的 石蜡组织中有较高的稳定性，利用FFPE标本进行 miRNA表达谱分析具有准确性和实用性^[7,8] ，因而我们选择较易获取的FFPE标本进行实验。由于宫 颈CIN病变常为局灶性,我们通过HE染色鉴别病变 部位，选择FFPE标本中病变部位组织进行实验,以 减少由于标本的原因而影响结果的可靠性。

miRNA在宫颈癌前病变也表现为异常表 达。Cheung等^[1]研究了宫颈癌前病变(CIN2/3） 中miRNA表达谱，发现与正常宫颈比较，12个 miRNA显示高表达，这些miRNA可能与凋亡和 周期调节有关。Pereira等^[6]研究了在宫颈癌、宫 颈高度和低度鳞状上皮内病变及正常宫颈组织中 miRNAs表达谱,发现至少有8个miRNA在宫颈正常 组织向癌前病变及宫颈癌发展过程中显示明显的 降调节，这些miRNA可能在肿瘤的发生中起抑制 作用；5个miRNA在正常宫颈向癌前病变和宫颈 癌转化过程中显示为上调，这些miRNA可能与宫 颈异常细胞向宫颈癌转化有关。我们的研究结果 也显示一些miRNA在HSIL中表现增高或下降，一 些在宫颈癌中明显上调的miRNA在HSIL中并不显 示高表达，而在宫颈癌中低表达的miRNA在HSIL 中也显示为低表达，如miR-218、miR-195、miR-199b-5p、miR-497，推测宫颈癌前病变向宫颈癌 转变可能与这些miRNAs的异常表达有关。芯片筛 查结果还显示，在正常宫颈与LSIL之间不存在明 显差异表达的miRNA，这可能与大部分LSIL病变 可向正常宫颈逆转有关。

研究显示miR-218及miR-21在肿瘤组织中异常 表达。miR-218在多种肿瘤组织和细胞中表现为下调并与肿瘤的生长、侵袭和转移有关，被认为是 肿瘤抑制因子^[9,10,11]。miR-218在宫颈癌组织、宫颈 上皮内瘤变、宫颈癌细胞株中表现为明显的下调 ^[4,12,13,14] ,能明显抑制宫颈癌细胞侵袭和迁移^[15,16] 。研 究已经显示miR-21在多种肿瘤组织中表达增高， 如头颈癌^[17] 、子宫内膜样癌 ^[18]、肺癌 ^[19]等。也有报 道miR-21与宫颈癌有关，在多种宫颈癌细胞及宫 颈癌组织中表达明显增高^[15,20]，而在癌前病变组织 中并不增高^[21]。我们的结果与以上研究一致，提示 miR-218在正常宫颈向宫颈癌转化过程中可能起抑 癌基因的作用，而miR-21作为癌基因起作用。

miRNA在肿瘤发生过程中的作用尚不明确， 对靶基因的功能分析有助于我们对miRNA作用机 制的理解。靶基因的预测显示miR-218及miR-21 有许多靶基因，一些靶基因在某些肿瘤中得到验 证，如miR-218的靶基因LAMB3、Robo1 ^[22,23,24]， miR-21的靶基因 PDCD4,PTEN等^[25,26]。通过靶基 因的功能分析，这些基因与肿瘤细胞的生长、凋 亡、黏附和迁移等有关。研究显示miR-218通过 作用于靶基因LAMB3与头颈鳞状细胞癌的发生有 关 ^[24]。又有研究发现miR-218和 LAMB3的多态性 与宫颈癌的易感性有关^[27]。Robo1被认为是一个 原癌基因，具有肿瘤迁移的活性，miR-218能通过 Slit2/Robo1途径，抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转 移^[22,23]。研究也显示miR-21能通过作用于PTEN和 PDCD4促进肿瘤细胞增长^[18,26]，参与肝细胞癌的侵 袭和迁移^[25]。这些研究显示miR-218及miR-21通过 调节其下游的靶基因参与肿瘤的发生发展。

我们的研究显示，miRNA在宫颈癌及癌前病 变中有异常表达，这些miRNA可能与肿瘤的发生 发展有关，有可能成为潜在的肿瘤生物标志物和 分子靶标，然而这些miRNA在宫颈癌中的作用还 有待进一步研究，对miRNA靶基因的功能研究将 有助对miRNA在宫颈癌发生发展机制的理解。