PTEN基因定位于人类染色体10q23，编码一 种双特异的磷酸脂质酶，被认为是一种抑癌基 因。早期研究普遍认为PTEN突变是肿瘤发生的主要原因，近几年的研究发现某些肿瘤中并未检测 到PTEN基因的突变，或突变频率很低，如胃癌、 肺癌、某些妇科肿瘤等^[1,2,3]，却发现PTEN基因高 甲基化与这些肿瘤的发生有关。已有研究表明， 多种基因的异常甲基化与食管癌的发生有关，如 p16、E-Cadherin及FHIT基因在食管癌中甲基化频 率均在50%以上^[4,5,6]，但是PTEN基因甲基化在食管 癌中的研究却少有报道。本研究检测食管鳞状细 胞癌中PTEN基因启动子区甲基化状态和PTEN基 因mRNA表达情况，旨在分析PTEN基因甲基化在 食管癌发生、发展中的作用以及PTEN基因mRNA 失表达与其甲基化之间是否存在相关性，以期对 食管癌发生的分子机制有更深入的认识。 1 资料和方法 1.1 研究对象

收集2007年8月至2010年2月在河北医科大学 第四医院胸外科行食管癌根治性切除术的患者94 例，其中男67例，女27例，年龄26~75岁，平均年 龄（59.0±8.91）岁，患者术前均未行化疗和放疗。 按UICC标准进行TNM分期，其中Ⅰ期9例，Ⅱ期53 例，Ⅲ期30例，Ⅳ期2例。按肿瘤侵及深度，T1 11 例，T2 14例，T3 61例，T4 8例；有区域淋巴结转移 的35例，无转移的59例。其中食管上段癌14例，中 段癌47例，下段癌33例。所有患者均在其出院后复 查病历，以确认诊断信息无误。 1.2 标本采集

同时采集肿瘤组织及距肿瘤组织≥3 cm的癌旁 组织约1/2黄豆大小，分别将其置于经 0.1%焦碳酸 二乙酯（DEPC）水处理后并高压消毒过的1.5 ml Eppendorf 管中，液氮速冻，然后转运至-80℃冰箱 保存备用。均经术后病理证实：肿瘤组织均为食管 鳞状细胞浸润癌，癌旁组织均为非肿瘤组织。 1.3 实验方法

以蛋白酶K(德国Merck公司)消化，酚氯仿异 戊醇抽提法提取组织DNA。将提取的组织DNA进 行亚硫酸氢钠处理。将健康者外周血白细胞DNA 用SssI甲基转移酶(新西兰BioLabs公司)处理，并 进行亚硫酸氢钠处理后作为甲基化阳性对照。以 Trizol( 美国Invitrogen公司)法提取总RNA。 1.4 甲基化特异性PCR(MSP)法

P T E N基因甲基化和非甲基化引物设计参 照Yang等^[7]报告的文献。用于检测PTEN甲基化 (PTEN-M)引物序列为：5’-TTC GTT CGT CGT CGT CGT ATTT-3’(上游)和5’-GCC GCT TAA CTC TAA ACC GCA ACCG-3’(下游)；检测PTEN非甲基 化(PTEN-U)引物序列为：5’-GTG TTG GTG GAG GTA GTT GTTT-3’(上游) 和5’-ACC ACT TAA CTC TAA ACC ACA ACCA -3’(下游)。取经亚硫酸盐处 理后DNA约100 ng进行MSP。反应条件为：采用 Hot-start方法进行PCR，循环参数为94℃预变性5 min，之后加入Taq-DNA聚合酶（北京赛百盛）， 然后94℃变性30 s、65.5℃(甲基化引物)或62.5℃ (非甲基化引物)退火45 s、72℃延伸1 min，35个循 环后，72℃继续延伸5 min，扩增产物为206bp (甲 基化)和162bp(非甲基化)。

以经SssΙ甲基转移酶处理的健康者外周血DNA 为甲基化阳性对照，以去离子水作为阴性对照。 取PCR扩增产物10 μl，用3%琼脂糖凝胶电泳，以 Alphalmager TM2200型凝胶成像系统观察并记录 图像 。并留取PTEN-M、PTEN-U的MSP产物经 3730测序仪进行双向测序分析(上海英骏生物技术 有限公司)以证实结果的可靠性。

将单纯出现甲基化条带者或同时出现甲基化 条带和非甲基化条带者确定为甲基化状态；将单 纯出现非甲基化条带确定为非甲基化状态。 1.5 RT-PCR法

PTEN及GAPDH引物序列参照白伟良等^[8]的 设计。PTEN引物：5’-TTT GAA GAC CAT AAC CCA CCA-3’ (上游)； 5’-TCA TTA CAC CAG TTC GTC CCT-3’ (下游)。2，3-二羟基丙醛-3-磷酸脱 氢酶(GAPDH)内参照引物：5’- AGG TGA AGG TCG GAG TCA ACG -3’ (上游)，5’-AGG GGT CAT TGA TGG CAA CA -3’ (下游)。应用RT-PCR试剂 盒(A3500，美国Promega公司)反转录合成 cDNA 第一链。在20 μl反应体系中加入cDNA 2 μl，循 环参数：94℃预变性 5 min 后，94℃30 s；53℃ (PTEN)、59℃(GAPDH)45 s；72℃60 s；35个循 环，最后72℃延伸 5 min，扩增过程采用去离子水 作为阴性对照。扩增的PTEN及GAPDH PCR产物 大小分别为136 bp、102 bp。将PCR产物于3%琼 脂糖凝胶电泳，经凝胶成像分析系统摄影，观察 PTEN及GAPDH基因mRNA表达情况。

以同时出现PTEN和GAPDH扩增条带者为 PTEN mRNA表达阳性；以仅出现GAPDH条带、 未出现PTEN条带者为PTEN mRNA表达阴性。 1.6 统计学方法

采用实际观察值(百分比)表示各统计量，数 据分析采用卡方检验及Phi相关系数检验，应用 SPSS11.5软件包完成，双侧P＜0.05为差异有统计 学意义。 2 结果 2.1 PTEN基因的甲基化检测结果

PTEN基因的甲基化在食管癌组织中显著 高于食管正常组织 (P=0.00)，见表 1，图 1、2。

表 1(Table 1)

表 1 食管癌和癌旁正常组织中PTEN甲基化分布[n(%)] Table 1 Distribution of PTEN methylation patterns in ESCC tissues and adjacent normal tissues[n(%)] Notes:ESCC:esophageal squamous cell carcinoma;M: methylation pattern;U: unmethylation pattern

表 1 食管癌和癌旁正常组织中PTEN甲基化分布[n(%)] Table 1 Distribution of PTEN methylation patterns in ESCC tissues and adjacent normal tissues[n(%)]

MSP:methylation specific polymerase chain-reaction;T1,T2 and T3: ESCC tissues;N1,N2 and N3: adjacent normal ESCC tissues;P: positive control of PTEN gene methylation pattern with genomic DNA treated by SssΙ; Ma: 100bp DNA marker; M: PTEN gene methylation pattern (206bp); U: PTEN gene unmethylation pattern (162bp) 图1 MSP法检测食管癌和癌旁正常组织中PTEN甲基化情况 Figure 1 PTEN gene methylation pattern in ESCC tissues and adjacent normal tissues detected by MSP

1,2,3,4,6:positive PTEN mRNA expression;5:negative PTEN mRNA expression;M:100bp DNA marker 图2 RT-PCR检测PTEN基因mRNA表达 Figure 2 PTEN mRNA expression detected by RT-PCR

94例浸润癌中，淋巴结转移阳性组和阴性组PTEN 基因甲基化频率分别为62.9%和35.6%，阳性组PTEN基 因甲基化化频率显著性高于阴性组(P=0.01)，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 食管癌组织中PTEN甲基化模式与临床病理特征的关系[n(%)] Table 2 Relationship of PTEN gene methylation patterns and clinical characteristics in ESCC tissues[n(%)]

表 2 食管癌组织中PTEN甲基化模式与临床病理特征的关系[n(%)] Table 2 Relationship of PTEN gene methylation patterns and clinical characteristics in ESCC tissues[n(%)]

94例浸润癌中，T1+T2组和T3+T4组PTEN基因 甲基化频率分别为56.0%和42.0%，两组相比，PTEN 基因甲基化频率差异无统计学意义(P=0.23)，见表 2。 2.4 PTEN基因甲基化与食管癌临床病理分期的关系

94例浸润癌中，Ⅰ+Ⅱ期组和Ⅲ+Ⅳ期组PTEN基因 甲基化频率分别为40.3%和56.3%，两组相比，PTEN 基因甲基化频率无显著性差异(P=0.14)，见表 2。 2.5 PTEN mRNA表达定性检测结果

在94例食管癌组织中，63例( 67.0%) PTEN mRNA表达阳性，31例(33.0%) 表达阴性。 2.6 PTEN mRNA表达与其基因甲基化的关系

PTEN mRNA表达阳性的63例肿瘤组织中， 20例(31.7%)发生了PTEN基因的甲基化，而PTEN mRNA表达阴性的31例肿瘤组织中，23例(74.2%) 出现PTEN基因的甲基化。在PTEN mRNA失表达 个体中，PTEN基因的甲基化频率显著升高，显示 食管癌肿瘤组织中PTEN基因mRNA的失表达与其 甲基化状态有显著的相关性(Phi=-0.40,P＝0.00) ， 见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 食管癌中PTEN mRNA表达与其甲基化的关系[n(%)] Table 3 Correlation between PTEN mRNA expression and methylation patterns in ESCC tissues[n(%)] Notes:ESCC:esophageal squamous cell carcinoma;M: methylation pattern;U: unmethylation pattern

表 3 食管癌中PTEN mRNA表达与其甲基化的关系[n(%)] Table 3 Correlation between PTEN mRNA expression and methylation patterns in ESCC tissues[n(%)]

通常认为基因突变、杂合性缺失(LOH)、启动 子高甲基化是抑癌基因失活并引起肿瘤发病的主 要原因。其中肿瘤抑制基因CpG岛的高甲基化已 成为研究的热点领域，食管癌也不例外。DNA甲 基化是真核细胞DNA最普遍的修饰过程，它不改 变DNA的一级结构并且在细胞正常发育、基因表 达模式以及基因组的稳定性中起着至关重要的作 用。DNA甲基化是肿瘤发生过程中常见的分子改 变之一，包括基因组总体的广泛性低甲基化和某 些特定基因启动子区域的高甲基化。对食管癌甲 基化的研究将有助于深入了解食管鳞癌发生的分 子机制，并为筛选用于食管鳞癌早期诊断和检测 其复发和转移的特异性分子标志物提供极具价值 的理论依据。

PTEN是一种抑癌基因，结构上，PTEN与鸡张力蛋白和牛辅助素有广泛同源性，在PTEN cDNA的5'端长的非翻译区含多个CG重复序列，这 为甲基化调节提供了可能。功能上，该基因编码 的蛋白PTEN能特异性地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷 酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3)去磷 酸化，拮抗PI3K/AKT信号转导通路，具有调节细 胞生长、增殖、迁移、分化等多种效应。体内外 实验还表明，PTEN可使FAK脱磷酸，从而阻碍肿 瘤细胞的扩散、转移、侵袭。

虽然PTEN突变与多种肿瘤的发生密切相关， 但在一些肿瘤尤其是散发性肿瘤中并未检测到 PTEN基因的突变，或突变频率很低，推测在这些 肿瘤中可能存在着突变以外的其他机制，如表遗 传学的修饰、基因的甲基化。本研究中观察到， 在食管鳞状细胞癌中PTEN甲基化频率为43.7%， 与食管正常组织相比存在着显著差异，认为PTEN 甲基化与食管鳞癌的发生密切相关，这也与一些 研究者的研究一致。一些研究者分别在胃癌^[9]、肺 癌^[2]、散发性乳腺癌^[10]、宫颈癌^[3]的研究中，发现 存在PTEN基因不同程度的甲基化，PTEN甲基化 频率在19%~58%，并且认为PTEN甲基化与这些肿 瘤的发生密切相关。因此推测，除PTEN基因突变 与肿瘤的发生密切相关外，PTEN甲基化也是包括 食管癌在内的某些肿瘤发生的重要机制。

本研究显示，有淋巴结转移者PTEN甲基化高 达62.9%，显著高于无淋巴结转移者，PTEN甲基 化与食管癌的淋巴结转移密切相关，预示着PTEN 甲基化可能与食管癌预后不良有关。其原因可能 为正常PTEN基因可使FAK脱磷酸，从而阻碍肿瘤 细胞的扩散、转移，而一旦发生PTEN基因甲基 化，使PTEN基因表达受到抑制，最终造成肿瘤细 胞的扩散、转移。这在一些研究中也得到证实， Yang等^[7]在宫颈癌和卵巢癌及Kang等^[9]在胃癌的 研究中均发现PTEN甲基化与淋巴结转移或预后有 关。由于本研究未能对术后患者随访观察，所以 PTEN基因的甲基化情况与患者生存的关系无法确 定，这有待于今后的研究来进一步证实PTEN甲基 化在食管癌预后中的作用。此外，由于循环血中 存在肿瘤组织的游离DNA，所以，检测循环血中 PTEN基因的甲基化状态有可能为食管癌的早期筛 查、监测食管癌的复发和转移提供新的靶点。

此外本研究结果还显示，在食管癌中PTEN甲 基化与其基因失表达密切相关，提示PTEN甲基化 是引起其基因表达异常的主要机制，这也与许多 研究者的结果一致。Rizvi等^[11]在印度人宫颈癌研 究中发现，在甲基化阳性病例中有41%出现PTEN 的表达缺失，并证实PTEN高甲基化与其基因失表 达相关。在一项乳腺癌的研究中也证实了PTEN甲 基化引起基因失活，导致肿瘤发生^[12]。Fan等^[13]在 体外实验中表明，在腺样囊性癌细胞系中，PTEN 高甲基化引起该基因低表达。并在甲基化的细胞 系中用去甲基化制剂处理后，可恢复PTEN基因的 mRNA表达，得出结论PTEN基因甲基化正是引起 表达缺失的一个主要原因。这都表明PTEN基因甲 基化导致其基因失活，而PTEN基因失活，可通过 不同途径引起细胞过度增殖，抑制细胞凋亡，从 而导致了肿瘤的转化和生长。

综上所述，本研究从表遗传学(基因甲基化)以 及转录(mRNA)水平上，较深入地探讨了食管癌发 生的分子机制，证实PTEN甲基化是食管癌发生中 常见的分子事件，并与食管癌预后有关；此外， PTEN甲基化还是其基因失活的重要原因。这为进 一步研究PTEN基因与肿瘤的关系奠定了基础，同 时也为食管癌的防治提供了理论依据。