Hedgehog信号通路最初在果蝇中发现， 其功能是胚胎发展的初始调节器，哺乳动物的 Hedgehog信号转导包含三个Hedgehog同源体： Sanic(Shh)、Indian和Desert^[1]。Hedgehog信号级联 最初是Hedgehog结合在十二跨膜蛋白结合1内。内 在的Ptch和解除抑制的Smo激活胶质瘤相关癌基因（Gli）转录因子^[2]。Gli转录因子存在三种形式，Gli-1、Gli-2和Gli-3 ^[3]。尽管这个通路的详细机制 尚未被了解，一个完整长度Gli-1被输送到细胞核 以激活Hedgehog靶基因。Gli-1是Hedgehog的靶基 因，其功能仅是作为一种反式作用因子，被认为 是Hedgehog通路激活的标志物^[4]。

最近的研究显示各种器官的癌症，如皮肤^[5]、小脑^[6]、肺^[7]、骨^[8]、胰腺^[9]、前列腺^[10]、子宫颈^[11] 和乳腺^[12]，都伴有配体依赖的Hedgehog信号通路 的激活。Shh、Ptch和Gli-1已被报道在乳腺癌中过度 表达。此外，已有报道雌激素受体和Gli-1核易位之 间呈正相关，并且进一步研究显示激素诱导的Shh 表达激活了Hedgehog通路、促进了细胞增殖^[13]。

乳腺癌是异型性很高的肿瘤之一，伴有各种 组织学、表型和临床行为。总体来说，其系统治 疗取决于激素受体状态、人类表皮生长因子受体2 （HER2）和Ki 67标记指数。还有一些其他肿瘤标 志物与乳腺癌的预后相关。

这项研究的目的是评估乳腺癌中Hedgehog信 号蛋白的表达与已知临床病理参数的关系，并且 比较患者生存率的差异，进而研究Hedgehog信号 蛋白在乳腺癌预后中的意义。 1 资料和方法 1.1 临床样本

收集1999年1月—2007年8月在赣南医学院 第一附属医院行切除术的334例原发性乳腺癌患 者。患者均为女性，年龄30~82岁（平均年龄51.3 岁），研究人群的临床病理资料，见表 1。福尔 马林固定石蜡包埋组织并且对临床数据进行回顾 性收集。核分级和组织学分级均根据诺丁汉分级 系统进行评估。肿瘤分期按照美国癌症联合委员 会第7版（AJCC）标准进行评估。334例患者中， 322例患者有完整的生存资料及随访数据。中位 随访时间为术后75.1月（范围0~179月）。21例 （6.3%）患者出现局部复发，62例（18.6%）患 者发生远处转移和36例（10.8%）患者随访期间死 亡。本研究由赣南医学院医学伦理委员会批准。

表 1(Table 1)

表 1 Hedgehog相关蛋白与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系 Table 1 Relationship between Hedgehog related proteins expression and clinicopathologic factors of breast carcinoma Notes：*：P＜0.05

表 1 Hedgehog相关蛋白与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系 Table 1 Relationship between Hedgehog related proteins expression and clinicopathologic factors of breast carcinoma

组织块切片厚度为5μ m，置于多聚- L -赖 氨酸的载玻片上，60℃烤箱中烘烤40 min，脱 蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸盐缓冲液微波抗原修 复。PBS冲洗，含3%H2O2的甲醇中室温下孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲 洗。主要抗体在4℃下孵育12 h。主要抗体为： Shh(1:200,EP1190Y,Epitomics公司)，Ptch(1:200, ab53715,Abcam公司)，Smo(1:100,ab72130,Abcam)， Gli-1(1:50,ab92611,Abcam公司)，Gli-2(1:400, ab7181,Abcam公司)，Gli-3(1:400,PAB10052,Abnova 公司)，E R ( 1:3 0 0 ,6 F 11 ,N o v o c a s t r a公司)， PR(1:600,Novocastra公司)，HER2(1:1 800,polyclonal 公司)和Ki-67(1:200,MM1公司)。免疫组织化学染色 使用过氧化物酶/DAB显色试剂盒（Dako公司）。 用苏木精对比染色，蒸馏水冲洗，60℃温水泡0.5 min，酒精脱水12 min、透明、包埋。

免疫组织化学染色玻片由两位病理医生独立 审查。Shh、Ptch、Smo阳性染色定位于细胞质， Gli-1、Gli-2、Gli-3定位于细胞核。染色强度分级 如下：0：阴性；1：弱；2：中度；3：强。百分 比分数按阳性细胞百分数分为：0：﹤5%；1： 5%~25%；2：＞25%~50%；3：＞50%~75%和4： ＞75%。强度得分与百分比得分相乘产生免疫反应 得分（IS）。阴性表达被定义为IS低于4。 1.3 肿瘤表型分类

乳腺癌表型按照2011圣加伦共有序列分类。 ER和P R免疫组织化学染色用奥尔雷德方法进 行评估。HER2免疫组织化学结果按如下得分判 定：0：无染色；+：在肿瘤细胞中完整膜染色≤ 10%；++：完整膜染色的强度>10%肿瘤细胞； +++：完整膜染色>30%浸润性肿瘤细胞。0和+ 为阴性，++、+++为阳性。表型分类如下：管腔 A(LumA)型：ER和（或）PR阳性，HER2阴性， Ki67指数<14%。管腔B型：HER2阴性（LumB、 HER2阴性）型：ER和（或）PR阳性，HER2阴 性和Ki67指数≥15%；HER2阳性（LumB、HER2 阳性）型：ER、PR阳性，HER2阳性和任意Ki67 值；三阴性型：ER、PR和HER2阴性。 1.4 统计学方法

数据分析使用SPSS 13.0版本完成。Hedgehog 相关蛋白与临床特征及乳腺癌表型之间的关系通 过卡方检验来分析。患者的生存使用Kaplan-Meier 生存分析，同时使用时序检验进行单因素分析。 P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 Shh、Ptch、Smo、Gli-1、Gli-2和Gli-3的免疫 组织化学结果

Shh、Ptch和Smo位于细胞质，Gli-1、Gli-2和 Gli-3位于细胞核，见图 1。334例乳腺癌中，Shh、 Ptch、Smo、Gli-1、Gli-2和Gli-3的阳性表达率 分别为49.1%（164/334）、54.8%（183/334）、 22.5%（75/334）、42.2%（141/334）、75.4% （252/334）和57.2%（191/334）。

A：Shh；B：Ptch；C：Smo；D：Gli-1；E：Gli-2；F：Gli-3 图1 Shh、Ptch、Smo、Gli-1、Gli-2和Gli-3在乳腺癌组织中的阳性表达（SP ×40） Figure 1 Positive expression of sonic hedgehog (Shh), patched (Ptch), smoothened (Smo), and glioma-associated oncogenes(Gli-1, Gli-2, and Gli-3) in breast carcinoma(SP ×40)

淋巴结转移与Shh、Ptch、Gli-3的表达相关 （P分别为0.001、0.025和0.000）。Shh和Ptch表达 与分期显著相关（P分别为0.007和0.037）。核分 级与Smo（P=0.004）和Gli-3（P=0.026）有关。 组织学分级与Smo（P=0.007）有关。ER表达与 Ptch(P=0.000)、Smo(P=0.000)、Gli（P=0.008）、Gli-2（P=0.000）和Gli-3（P=0.004）有关。PR表 达与Smo（P=0.001）、Gli-1（P=0.031）和Gli-3 （P=0.003）有关。HER2表达与Shh(P=0.000)显著 相关，见表 1。 2.3 Hedgehog相关蛋白表达与乳腺癌表型之间的 关联

Shh、Ptch、Smo、Gli-1、Gli-2、Gli-3的表达 在乳腺癌不同表型之间显著不同（P分别为0.000、 0.000、0.004、0.039、0.031、0.003）。143例 （49.3%）乳腺癌组织中检测到Shh阳性表达，Shh 的表达与乳腺癌组织中HER2型（74.1%）的关系 有统计学意义。158例（54.4%）乳腺癌组织中检 测到Ptch表达，Ptch的表达与乳腺癌组织中LumB HER2阴性型（76.7%）的关系有统计学意义。在 65例（22.4%）乳腺癌组织中检测到Smo表达， Smo的表达与乳腺癌组织中HER2型、三阴型（分 别为31.0%、30.9%）的关系有统计学意义。在119 例（41.0%）乳腺癌组织中检测到Gli-1表达，Gli-1 表达与乳腺癌组织中LumBHER2阳性型(64.0%) 的关系有统计学意义。在215例（74.1%）乳腺 癌组织中检测到Gli-2表达，Gli-2的表达与LumA (85.1%)、LumBHER2阴性（81.4%）和LumB HER2阳性型（80.0%）的关系有统计学意义。在 168例（57.9%）乳腺癌组织中检测到Gli-3表达， 但Gli-3的表达与任何一种乳腺癌亚型的关系都无 统计学意义，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 Hedgehog相关蛋白与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系 Table 2 Relationship between Hedgehog related proteins expression and clinicopathologic factors of breast carcinoma Notes:a: randomly selected 290 cases;*:P＜0.05;TNBC:triple negative breast carcinoma

表 2 Hedgehog相关蛋白与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系 Table 2 Relationship between Hedgehog related proteins expression and clinicopathologic factors of breast carcinoma

乳腺癌的肿瘤分期（P= 0 .0 0 01）与患者的 总体生存显著相关。在分析的所有Hedgehog相 关蛋白中，Gli-2阳性组较Gli-2阴性组生存率差 （P=0.012），见图 2。Shh、Ptch、Smo、Gli-1和Gli-3 与患者的预后关系无显著的统计学意义，见表 3。

Cell proliferation was assessed by CyQUANT NF proliferation kit at indicated times after serum stimulation. Proliferation rate was expressed as increased percentages = ( fluorescence density at nh – fluorescence density at 0h)/Fluorescence density at 0 h 图2 乳腺癌患者Gli-2阳性组和Gli-2阴性组的KaplanMeier生存分析 Figure 2 Kaplan-Meier survival analysis of breast carcinoma patients in Gli-2 positive and Gli-2 negative groups

表 3(Table 3)

表 3 所有生存患者临床病理特征与预后的关系 Table 3 Relationship of clinicopathologic factors and prognosis of all survival patients Notes: selected cases were available for follow-up, some cases couldn't be followed up due to contact information change;*: P<0.05

表 3 所有生存患者临床病理特征与预后的关系 Table 3 Relationship of clinicopathologic factors and prognosis of all survival patients

Hedgehog信号途径在胚胎发育期间控制细胞 命运和器官形成中发挥重要作用；Hedgehog信号 途径中断导致先天性无脑、面部和其他器官形成 缺陷^[14]。Hedgehog信号途径激活突变与基底细胞 癌^[15]和髓母细胞瘤^[16]有关。

Kubo等^[17]对52例乳腺癌组织进行免疫组织化 学染色，评估Shh、Ptch和Gli-1的表达，结果肿瘤 细胞分别在52个总标本中的第52、50和5个标本中 过度表达Shh、Ptch和Gli-1。另外，4个人类乳腺 癌细胞株显示Shh、Ptch和Gli-1表达增加。然而， 根据他们的结果，在T分期，淋巴结受累和肿瘤总淋巴结转移（TMN）分期之间差异无统计学意 义。ten Haaf等^[18]确定在人类乳腺癌中Gli-1蛋白 水平升高与癌症的侵袭性行为相关，如高肿瘤分 期和淋巴结状态。此研究显示Hedgehog相关蛋白 的过度表达与较大的肿瘤大小（Gli-3）、更多的 淋巴结转移（Shh、Ptch和Gli-3）、更高的分期 （Shh和ptch）、更高的核分级（Smo和Gli-3）和 更高的组织学分级（Smo）有关联，均表明肿瘤的 侵袭性行为与Hedgehog相关蛋白有关。

Hedgehog相关蛋白和乳腺癌患者总体生存期 间的关系有很多研究。根据ten Haaf等^[18]的报道， Gli-1高表达组总体生存率低。O'Toole等^[19]评估了 在279例浸润性导管癌中Hedgehog过度表达，并且 报道Hedgehog配体表达与转移风险增加和乳腺癌 死亡显著相关。很少研究Hedgehog相关蛋白表达 和其他器官恶性肿瘤的关系。Zhang等^[20]报道Gli-2 表达与肝细胞癌患者预后较差显著相关。Ding等^[21] 报道结肠癌手术后无转移组其Smo表达更低。另一 方面，Lee等^[22]报道Ptch和Gli-2阳性组的胃腺癌有 更好的总体生存率。然而，本研究显示Gli-2表达的 乳腺癌患者总体生存率更差，Hedgehog相关蛋白与 导致进一步侵袭性行为的临床病理特征相关。

Gli-2，哺乳动物Gli-转录因子家族的三员之 一，是已知主要作为介导Hedgehog信号细胞反应 的转录激活因子。Lewis ^[23]研究显示Gli-2在乳腺 发展中中断导致导管发育不良，从而导致人类乳 腺增生。然而，关于Gli-2和人类乳腺癌的研究 较少。根据Xuan等^[24]的报道：Gli-2表达与PR、 Ki67、淋巴结转移和临床分期相关。我们的研究 最先报道Gli-2表达在乳腺癌患者中有较差的总体 生存率，结果表明Gli-2可作为一个预后指标。

在2011年，第12届圣加仑国际乳腺癌会议专 家面组采用一个新的方法基于治疗目的的患者 分类^[25]。这个方法使用ER和PR免疫组织化学结 果、HER2状态和Ki67增殖指数识别肿瘤亚型。 （1）管腔A(LumA)型：ER和（或）PR阳性， HER2阴性，Ki67<14%；（2）管腔B型：HER阴 性（LumBHER2阴性）：ER和（或）PR阳性， HER2阴性和Ki67≥15%；（3）HER2阳性（LumB HER2阳性）型：ER、PR阳性，HER2阳性和任意 Ki67值；（4）三阴型：ER、PR和HER2阴性。

本研究显示，Shh表达在HER2型更高，Ptch表 达在LumBHER2阴性型更高，Gli-1表达在LumB HER2阳性型更高。除了内分泌治疗或曲妥珠单 抗靶向治疗外，这些表型均需要化疗。Hedgehog 途径可能是这些病例中化疗的治疗目标。Smo在 HER2和三阴型中表达更低，这也要求使用药物进 行化疗。推断非甾体类化疗药通过直接结合Smo 来抑制Hedgehog途径激活。Gli-2表达在LumA、 LumBHER2阴性和LumBHER2阳性型中更高。这 三型都是ER和（或）PR阳型。Xuan等^[24]报道Gli-2 表达与PR表达相关。然而，Gli-2和激素受体之间 的完整关系尚未发现。

在细胞中存在多条与乳腺癌发生发展相关的 信号转导通路：有归属于受体酪氨酸激酶(RTK) 介导的信号通路，有归属于雌激素调控的ER信号 通路，还有Notch信号转导通路、Wnt信号转导、 Hedgehog信号通路等都与乳腺癌的发生、浸润、 转移等有密切关系。随着对与乳腺癌相关信号转 导通路的深入研究发现，乳腺癌的发病机制十分 复杂，可能是上述信号途径中的两条或多条的共 同参与引起的^[26,27]，虽然具体的机制还不清楚，但 一定与癌基因和抑癌基因相关，这就说明一些因 子的生物学活性成为信号转导途径的关键环节。 因此，对细胞信号转导通路的研究有助于阐明乳 腺癌的发病机制。同时，对肿瘤细胞信号转导通 路的分子靶向药物研究为人类防治肿瘤开辟了新 的道路，尤其对肿瘤细胞增殖与生存、肿瘤血管 生成等方面的具有高选择性的分子靶向药物的研 究有助于我们联合化疗、放疗，显著提高疗效。

总之，Shh、Ptch、Smo、Gli- 1、Gli- 2和 Gli-3表达与各种临床病理指标显著相关，表明 Hedgehog途径的激活与更多的侵袭性临床行为相 关。最重要的是，Gli-2表达的患者预后较差，表 明Gli-2是一个有前途的预后指标。评估Hedgehog 相关蛋白可预测患者的预后，为患者选择进一步治疗方案时提供参考，Hedgehog途径可能是乳腺 癌患者化疗中一个有用的治疗靶点。