前列腺癌是欧美男性发病率最高的恶性肿瘤^[1]， 近年来在我国的发病率逐年上升，已居男性泌尿生 系肿瘤第三位^[2]，前列腺癌进展机制尚不清楚。膜 联蛋白(Annexin)是一种高度保守、广泛表达，具有 多种重要功能的钙依赖磷脂结合蛋白超家族，可以 分为A1、A2、A3等近20种类型，在细胞信号转导、 钙离子通道的形成、炎性反应、肿瘤细胞的增殖与 分化、细胞骨架蛋白间的相互作用和维持细胞外 基质的完整性等方面具有重要作用[3-4]。AnnexinA2 属于膜联蛋白家族中的一员，又名Annexin Ⅱ、 ANXA2、P36、LIP2、LPC2等，近年来研究表明 AnnexinA2的异常表达与人类多种类型肿瘤的的 进展相关，例如和乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠 癌、肾癌、前列腺癌以及头颈部鳞状上皮癌等的 浸润和转移密切相关^[5]。本文对AnnexinA2的异常 表达在前列腺癌中进展的作用机制作初步探讨。 1 材料与方法 1.1 主要实验材料、试剂及仪器

即用型免疫组织化学超敏SP试剂盒及DAB辣 根过氧化酶酶底物显色剂为福州迈新生物技术开 发公司产品。前列腺癌LNCaP（低转移潜能）、 PC-3（低转移潜能）、C4-2B（高转移潜能）细胞 株购自中南大学细胞中心，RPMI 1640培养液、胰 酶、胎牛血清为美国Gibco公司产品。pSilencer-空 载体为pSilencer 1.0-U6，AnnexinA2的siRNA干扰 重组载(ANXA2-siRNA -pSilencer 1.0-U6)，对照干 扰重组载体(mock gene-siRNA-pSilencer 1.0-U6)。

AnnexinA2 siRNA干扰序列如下：5'- GCG GGA UGC UUU GAA CAU UDT DT -3'（正义）， 5'- AAU GUU CAA AGC AUC CCG CDT DT -3'（反 义）；对照mock gene序列为：5'- CGUACGCGG AAUACUUCGA dTdT- 3'（正义），3'- dTdTGCA U G C G C C U U A U G A A G C U - 5 ' （ 反义） 。 Lipofectamine2000，Transwell chamber，Matrigel 均为美国Santa Cruz 产品；BCA Assay Reagent、 鼠抗人Annexin A2抗体、鼠抗人β-actin抗体，辣根 过氧化物酶标记羊抗鼠二抗均为Santa Cruz公司产 品；ECL(Enhanced chemiluminescence)试剂盒，瑞 典Amersham公司产品。

1.2 临床资料

前列腺癌标本均来自上海中医药大学附属普 陀医院及中南大学湘雅二医院，2007年1月—2011年12月泌尿外科住院患者，经前列腺癌根治术或 穿刺活检获得，年龄56~85岁，中位年龄是72.8 岁，术前或穿刺前均无药物、外科去势及放射治 疗史，前列腺癌根治术36例，穿刺活检49例，所 有标本均由两位资深病理学家独立作出诊断， 并经组织病理学检查证实为前列腺腺癌并给予 Gleason评分。 1.3 研究方法 1.3.1 免疫组织化学染色及结果判定

AnnexinA2 免疫组织化学染色采用SP法，对AnnexinA2切片行 热抗原修复，将切片置0.01M枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中煮沸(95℃,15~20min)，自然冷却20 min以 上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS 冲洗5 min×3次，鼠抗人膜联蛋白Ⅱ一抗(1:200稀 释)，4℃过夜。随机选取至少10个高倍镜视野（× 200），至少计数1 000个细胞，以积分法计算结 果。即根据每张切片的染色强度和阳性细胞比例 计分。着色强度：无色0分；浅黄色1分；棕黄色 2分；棕褐色3分。着色细胞比例：无着色0分； ＜30%为1分；30%~60%为2分；≥60%为3分。两 者相加0~2分为阴性或弱阳性；3~4分为阳性；5~6 分为强阳性。 1.3.2 脂质体转染及细胞系筛选

采用脂质体 转染试剂盒(Lipofectamine 2000)将AnnexinA2的 siRNA干扰载体(ANXA2-siRNA-pSilencer 1.0-U6) 质粒和对照载体(mock gene-siRNA-pSilencer 1.0-U6) 质粒分别转染AnnexinA2高表达PC-3细胞 系，同时将脂质体也转染PC-3细胞作为脂质体对 照组。共四个细胞株：PC-3、PC-3-Lip、PC-3- control vector、PC-3-ANXA2-siRNA。在转染24小 时收集细胞，采用Western blot检测AnnexinA2表达 水平，确定RNAi的效果，检测MMP-2/9的表达水 平。 1.3.3 噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)绘制细胞生长曲线

将PC-3、PC-3-Lip、PC-3- 空载体、PC-3-ANXA2-siRNA细胞株分别进行计 数。以每孔500个细胞接种于96孔培养板中，每孔 体积200 μl，每组设定5孔平行复孔，同时设空白 对照(仅培养液)，置CO₂培养箱中孵育，每隔24 h 每组检测一次，小心吸去上清液，每孔加入200 μl 新鲜RPMI 1640培养液，再加入5 mg/ml的MTT 20 μl，37 ℃继续孵育4 h后，终止培养，小心吸弃孔 内上清液，加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结 晶物充分溶解，以空白对照孔调零，ELX800酶标 仪490 nm处测定各孔的吸光度值(OD490值)，相对应 OD490值表示细胞增殖能力大小。OD=每24 hOD值 /第24 hOD值。连续检测7天，Excel对数据进行分析 处理，绘制细胞生长曲线。 1.3.4 Western blot分析

常规行总蛋白质抽提， 样品制备，Bradford法测定蛋白浓度，转膜，丽春 红染色，封闭，一抗结合 (浓度1:1 000)，摇床上 室温作用2 h，二抗结合，(浓度1:1 000)，ECL化 学发光法检测，暗室中压上X光片，曝光30 s至10 min，显影，洗片。 1.3.5 体外细胞侵袭能力检测

（1）用Matrigel 包被Transwell的聚碳酯膜：① Matrigel 4℃ 冰上过 夜解冻，混匀Matrigel，用RPMI 1640无血清培养 基1:100稀释Matrigel，将侵袭小室的上室浸泡在上 述Matrigel中约5 min，放在24孔板内，无菌工作台 内紫外灯照射2~3 h；② 每个插入子内加入100 μl 用RPMI 1640无血清培养液基1:30稀释的Matrigel， 于37℃、5% CO₂培养箱孵育至少4~5 h后，无菌工 作台内紫外灯照射过夜；③ 用预热的RPMI 1640 无血清培养液轻柔洗涤聚碳酯膜，包被好的聚碳 酯膜即可使用。（2）平衡侵袭小室腔：侵袭小室 腔的上下室分别加入200 μl、600 μl RPMI 1640无 血清培养液，37℃、5% CO₂培养箱孵育至少1h， 以提高细胞的黏附能力。（3）侵袭能力检测：① 细胞培养至80%融合时，收集细胞用含1%FBS的 RPMI 1640 培养液洗涤细胞3次；② 用含1%FBS 的RPMI 1640 培养液重悬细胞，调整细胞数为12.5 ×10⁴/ml；③ 侵袭小室腔的下室中加入600 μl 含 10%FBS的RPMI 1640培养液，上室中加入200 μl 细胞悬液，缓慢滴入，避免气泡；④ 37℃，5% CO₂培养箱中孵育40 h；⑤ 结晶紫染色：取出插 入子，PBS冲洗3次，无水乙醇固定2 min，PBS冲 洗1次，0.1%结晶紫染色15 min，自来水漂洗；⑥ 用棉签轻轻擦拭掉聚碳酯膜上表面的细胞，显微 镜下计数穿过聚碳酯膜的细胞，观察8个高倍视野 （×200）。穿过包被Matrigel滤膜的细胞为侵袭的 细胞。实验重复3次。 1.3.6 划痕实验

在6孔板中加入PC-3、PC-3- Lip、PC-3-control vector、PC-3-ANXA2-siRNA， 每组约5×10⁵个细胞，第二天用枪头在六孔板中作 横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞 3次，除去划下的细胞，加入无血清培养液。放入 37℃，5%CO2培养箱，培养。按0 h，24 h取样， 拍照。 1.3.7 迁移实验

用Transwell 在 24 孔板中浸泡 1 h；分别消化对数生长期PC-3、PC-3-Lip、PC-3- Control Vector、PC-3-ANXA2-siRNA细胞，分别计 数，用无血清培养液洗涤2 次并配成细胞悬液，每 孔加入100 μl 细胞悬液（约1×105个细胞）；下腔 室中加入含10%FBS的RPMI 1640 培养液；置37 ℃ 培养箱中孵育 20~24 h；取出 Transwell 用 PBS 洗 2 遍，5% 戊二醛固定； PBS 洗 2 遍，加入0.1%结 晶紫染色30 min，PBS 冲洗2 遍，用棉球擦去上表 面细胞，显微镜下观察计数。 1.4 统计学方法

应用SPSS17.0统计软件对实验结果进行统计 学分析，两两比较用t检验，组间多重比较采用 ANOVA LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意 义。 2 结果 2.1 AnnexinA2表达与前列腺癌Gleason评分的关系

在Gl e a s o n 评分为5 ~ 6 、7 、8 ~ 1 0 分中的 AnnexinA2阳性率分别是77.5%（31/40）、58.3% （21/36）、11.1%（1/9），三者之间表达差异 有统计学意义（P＜0.05），见图 1、表 1。随着 Gleason评分的增加，AnnexinA2表达下降。

A:AnnexinA2 expression was strong positive in PC with Gleason scores 5-6(positive signal as shown in the black arrow); B:AnnexinA2 expression was positive in PC with Gleason scores 7(3+4);C:AnnexinA2 expression was positive in PC with Gleason scores 7(4+3);D:AnnexinA2 expression was negative in PC with Gleason scores 8-10;PC:prostate cancer 图 1 AnnexinA2在不同Gleason评分前列腺癌中的表达(SP ×200) Figure 1 AnnexinA2 expression in prostate cancer with different Gleason scores(SP ×200)

表 1(Table 1)

表 1 AnnexinA2表达与前列腺癌Gleason评分的关系 Table 1 Relation between AnnexinA2 expression and Gleason scores in PC Notes:* :P=0.001,ANOVA LSD test;a: Gleason scores 5-6 vs. 7;b: Gleason scores 5-6 vs. 8-10;c: Gleason scores 7 vs. 8-10

表 1 AnnexinA2表达与前列腺癌Gleason评分的关系 Table 1 Relation between AnnexinA2 expression and Gleason scores in PC

Western blot方法检测AnnexinA2在不同转移潜 能前列腺癌LNCaP（低转移潜能）、C4-2B（高转 移潜能）和PC-3（低转移潜能）、PC-3M（高转 移潜能）细胞系中的表达情况。Annexin A2在前列 腺癌高转移潜能细胞系C4-2B、PC-3M中的表达水 平较低转移潜能细胞系LNCaP、 PC-3中的表达水 平明显下调( P < 0.01)，见图 2。

A: Annexin A2 expression detected by Western blot assay in four groups of PC cells;B: average relative gray of Annexin A2 expressions in four groups of PC cells;*: P < 0.01 图 2 不同转移潜能前列腺癌细胞系中AnnexinA2的表达情况 Figure 2 AnnexinA2 expression in prostate cancer cells with different metastasis potency

将待测的四组细胞：PC-3、PC-3-Lip、PC-3- control vector、PC-3-ANXA2-siRNA，均以相同的 细胞数目接种六孔板，连续7天测定OD值，绘制生 长曲线。从生长曲线可见，PC-3、PC-3-Lip、PC- 3-control vector 三组生长速度差异无统计学意义(P ＞0.05）；PC-3-ANXA2-siRNA生长速度增加，与 PC-3、PC-3-Lip、PC-3-control vector相比，差异有 统计学意义（P＜0.05），见表 2、图 3。

表 2(Table 2)

表 2 四组细胞生长曲线OD值 Table 2 OD values of growth curves of four groups

表 2 四组细胞生长曲线OD值 Table 2 OD values of growth curves of four groups

图 3 四组细胞生长曲线图 Figure 3 Growth curves of four groups

Western blot检测到PC-3-ANXA2-siRNA中 Annexin A2表达明显下调，而PC-3组，PC-3-Lip 组，PC-3-control vector组AnnexinA2表达无明显改 变，说明RNAi干扰效果满意，而空白载体及脂质 体对Annexin A2的表达并无影响，见图 4。同时， PC-3-ANXA2-siRNA中Annexin A2表达下降时， MMP-2、MMP-9表达却明显增加，说明在PC-3细 胞系中Annexin A2下调能导致MMP-2、MMP-9表 达的增加。

A: expressions of Annexin A2,MMP-2 and MMP-9 in PC-3,PC-3-Lip,PC-3-control vector and PC-3-ANXA2-siRNA cells detected by Western blot assay; B average relative gray of Annexin A2,MMP-2 and MMP-9 expressions in 4 groups of PC cells; *: P < 0.01 图 4 AnnexinA2下调对MMP-2、MMP-9表达的影响 Figure 4 Effects of down-regulating AnnexinA2 expression on MMP-2 and MMP-9 expression

体外侵袭小室实验检测发现：PC-3-ANXA2- siRNA中的侵袭细胞计数明显高于PC-3组、PC-3- Lip组、PC-3-control vector组（P<0.05），见图 5。 说明下调Annexin A2表达能增加前列腺癌PC-3细胞的体外侵袭能力。

Invasion abilities of PC-3,PC-3-Lip,PC-3-control vector and PC-3-ANXA2-siRNA cells detected by Transwell cabinet test ×200 图 5 体外细胞侵袭实验检测结果 Figure 5 Cell invasion experiment results in vitro

划痕实验检测发现：24 h后，往划痕中央迁移 的PC-3-ANXA2-siRNA组的细胞数目明显多于其 他三组（PC-3、PC-3-Lip、PC-3-control vector）， 见图 6。

图 6 四组前列腺癌细胞划痕实验比较 Figure 6 Scratch test results of PC cells in four groups

迁移实验检测发现，24 h后，迁移的PC-3- ANXA2-siRNA组细胞数目明显多于其他三组 （PC-3、PC-3-Lip、PC-3-control vector），见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 Transwell小室检测Annexin A2表达改变对前列腺癌细胞迁移能力的影响 Table 3 Effects of down-regulating of AnnexinA2 expression on migration of PC cells in Transwell cabinet test Notes:*: P<0.05,PC-3-ANXA2-siRNA comparison with other three groups,ANOVA LSD test

表 3 Transwell小室检测Annexin A2表达改变对前列腺癌细胞迁移能力的影响 Table 3 Effects of down-regulating of AnnexinA2 expression on migration of PC cells in Transwell cabinet test

近年来一些研究发现AnnexinA2的异常表达与人类前列腺癌的进展密切相关。我们研究发 现：AnnexinA2在Gleason评分为5~6、7、8~10 分的前列腺癌中阳性率分别是77.5%（31/40）、 58.3%（21/36）、11.1%（1/9），表明随着前列腺 癌Gleason评分的增加AnnexinA2表达下降，说明 AnnexinA2表达下调与前列腺癌的分化程度增加有 关，即AnnexinA2表达下调前列腺癌的侵袭转移能 力增强，为进一步验证AnnexinA2表达下调是否促 进前列腺癌侵袭转移，我们进行了一系列细胞功 能实验。

通过MTT实验发现AnnexinA2下调表达能促 进前列腺癌细胞的生长，说明AnnexinA2具有生长 抑制作用，即AnnexinA2表达下调能促进前列腺癌 细胞侵袭转移，与Hiozawa等研究结果一致^[6]，并 认为其生长抑制作用机制可能为AnnexinA2能与 c-myc结合，而c-myc基因编码的蛋白质作为转录 因子在细胞增殖中具有重要的调节作用，从而影 响肿瘤细胞的增值^[7]。为进一步验证AnnexinA2表 达下调促进前列腺癌细胞侵袭转移能力增加的假 设。Western blot检测不同转移潜能前列腺癌细胞 系表达情况，AnnexinA2在高转移潜能C4-2B细胞 中的表达水平较低转移潜能PC-3、LNCaP明显下 调，差异具有统计学意义，说明AnnexinA2表达下 调促进前列腺癌细胞侵袭转移能力增加。我们进一步通过siRNA技术干扰AnnexinA2表达后，体外 侵袭实验发现siRNA组侵袭细胞计数明显高于其 他对照组，划痕实验和迁移实验发现siRNA组细 胞的体外迁移能力明显高于其他对照组，进一步 说明下调AnnexinA2表达能增加前列腺癌PC-3细胞 的体外侵袭和迁移能力。Yee等^[8]发现伴随前列腺 腺癌的进展过程中，其AnnexinA2表达水平呈逐渐 下降或缺失的趋势，而转染AnnexinA2基因的前列 腺癌细胞转移能力受到了显著抑制。Stewart等^[9]发 现AnnexinA2不表达的前列腺腺癌组织中mRNA水 平也很低，但AnnexinA2基因并没有缺失或突变， 推测AnnexinA2的表达可能是在转录或转录后水 平受到了抑制。我们的结果及以往的研究均提示 AnnexinA2可能是前列腺癌细胞转移特性的内源抑 制子，它的缺失表达可能在促进前列腺癌的侵袭 转移过程中起重要作用。

AnnexinA2可以和许多在肿瘤浸润和转移进程 中扮演重要角色的分子相互作用，促进多种类型 肿瘤的浸润和转移。主要包括S100家族成员、纤 溶酶原(PLG)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、血 管内皮生长因子(VEGF)、腱生蛋白C(TN-C)、组 织蛋白酶B (cathepsin B)、活化的白细胞黏附分子 (ALCAM)和肌成束蛋白(fascin)等。其分子机制如 下：(1)促进肿瘤新生血管的生成从而促进肿瘤的 浸润转移：通过与VEGF及S100A4 相互作用促进 血管形成^[10]；活化t-PA、PLG、组织蛋白酶B等蛋 白质并促进其下游的蛋白水解级联反应，促进新 血管的生成^[11]。(2) 通过以下途径促进肿瘤细胞的 浸润和转移：通过和抗黏附分子相互作用减弱肿 瘤细胞对细胞外基质成分的黏附，并刺激肿瘤细 胞释放大量蛋白酶水解细胞外基质，促进肿瘤细 胞的浸润和转移^[12]；通过和黏附分子(如ALCAM) 相互作用，调节不同时期肿瘤细胞的黏附和去黏 附，促进肿瘤的浸润和转移^[13]；通过和细胞骨架 成分结合分子(如肌成束蛋白)相互作用调节细胞运 动过程，促进肿瘤细胞的浸润和转移^[6]。

细胞外基质(extracell matrix ,ECM) 是阻止 肿瘤侵袭、转移的天然屏障，恶性肿瘤在侵袭及 转移必须突破正常组织ECM，在ECM成分降解 过程中,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs) 发 挥 了 重 要 作用，MMPs被分成三组: 胶酶(Ⅳ型胶原酶) 、基质溶素和间质胶原酶。 ECM主要由Ⅳ型胶原组成,而基质金属蛋白酶-2 和 基质金属蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase 2 and 9, MMP-2、MMP-9) 是降解Ⅳ型胶原最主要的酶， 可以降解上皮组织的ECM,从而促进恶性肿瘤的 侵袭与转移^[14] ，目前MMP-2、MMP-9表达增加已 作为肿瘤的侵袭转移的重要标志物之一，Western blot检测到PC-3-ANXA2-siRNA中AnnexinA2表达明显下调，而前列腺癌细胞中MMP-2、MMP-9表 达却明显增加，表明AnnexinA2表达下调导致前 列腺癌细胞侵袭转移能力的增高可能与MMP-2和 MMP-9表达增加有关。这一研究发现有助于阐明 前列腺癌的致病机制，并可望为前列腺癌的防治 提供新的靶标。