目前放射治疗为鼻咽癌的主要治疗手段，放 疗后局部区域复发是治疗失败的重要原因。鼻咽 癌存在放射敏感度的个体差异[1-2]，影响鼻咽癌放 射敏感度的主要因素包括肿瘤细胞乏氧、DNA损 伤修复、细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期等^[3]，有 文献报道血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）也在鼻咽癌中有不同程度 表达，并与鼻咽癌分期和放射敏感度密切相关^[4]。 本研究的前期实验结果提示：通过RNAi技术阻断 VEGF的表达可改变鼻咽癌细胞的生长、增殖、迁 徙等生物学行为^[5]，改变VEGF水平可能影响鼻咽 癌细胞的放射敏感度，但其分子机制尚不清楚^[6]。 本研究进一步探讨VEGF表达水平与鼻咽癌细胞放 疗敏感性的分子机制^[7]，为鼻咽癌的个体化治疗提 供重要参考。 1 材料与方法 1.1 稳定转染鼻咽癌细胞的构建

人鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE-2，细胞来 源、真核表达载体pU-VEGF-siRNA的构建、基因 转染与稳定筛选、鉴定方法详细见文献^[5]。构建针 对VEGF的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA细 胞系，分别设定CNE-2细胞实验组（CNE-2组）、 1个阴性对照质粒（CNE-2/Neg-siRNA组）和脂质 体稳定转染VEGF的CNE-2细胞（CNE-2/VEGFsiRNA 组）。 1.2 平板克隆形成实验检测细胞存活分数和放射生物学参数

将对数生长期的3组细胞分别以2.5 g/L胰蛋白 酶消化成单个细胞悬液,并作梯度倍比稀释,将不 同剂量所对应的细胞数种植到直径100 mm的培养 皿中（0、2、4 Gy照射组接种200个细胞，6 Gy 照射组接种400个细胞，8 Gy照射组接种600个细 胞，10 Gy照射组接种1000个细胞），每皿生长约 50~100个克隆的密度。每组各重复3次。待细胞 贴壁后分别接受0、2、4、6、8、10 Gy单次照射 （6 MV-X射线，剂量率为300 cGy/min）。静止 培养2~3周，当培养板出现肉眼可见的克隆时终止 培养。PBS清洗后加甲醇1 ml固定15 min，吉姆萨 液染色。将培养皿置于低倍显微镜下标记大于50 个细胞的克隆，肉眼计数克隆数。以0 Gy组计算 种植率：种植率(%) =克隆数/接种数×100%。并计 算存活分数SF，SF=照射后形成克隆数/（接种细 胞数×细胞种植率）。以SigmaPlot软件，根据单 击多靶模型SF=1-(1-e^-D/D0) N拟合细胞存活曲线， 得出D₀、N、Dq和2 Gy照射后的细胞存活分数 （surviving fraction after 2 Gy，SF2）等参数；根 据线性二次模型（L-Q模型）SF=e^-αD-βD2拟合曲线 得到各细胞的α、β、SF2值。

1.3 流式细胞技术分析细胞周期分布和细胞凋亡的影响

对数生长期的细胞用胰酶消化后，以1.0×10⁵ /ml 的密度传代、接种，贴壁后加入RPMI 1640培养 液培养24 h，加入新培养液。培养至72 h，胰酶消 化成单细胞悬液，冰PBS洗涤2次，1 000 g离心5 min。弃上清液，缓慢加入-20℃预冷的75%乙醇， 4℃保存。取细胞悬液，PBS洗涤，2 000 g离心5 min后，弃上清液。PI染液1.0 ml染30 min，488 nm 激发波长测定样品，620 nm带通滤片检测PI荧光。 每样本收集多于10 000个荧光信号，得出各期细胞 数占细胞总数的百分率^[5]。每组重复3次。 1.4 反转录PCR(RT-PCR）定量

CNE-2组、CNE-2/Neg-siRNA组和CNE-2/ VEGF-siRNA组细胞分别以每孔3×106个细胞接种 于6孔板，细胞贴壁后予4 Gy照射剂量（6 MV X射 线），以RT-PCR法分别检测照射前（0 h）及照射 后6、12、24 h 4个时间点的三组细胞细胞周期相 关调控因子的相对表达量[5-8]。TRIzol试剂提取各 组细胞总RNA，使用紫外分光光度计调整RNA浓 度为1 g/L，以β-actin为内参照，在25μl体系中加入 VEGF上下引物0.5 μl，TaqDNA聚合酶1μl，95℃预 变性5 min后，按94℃ 30 s，58℃ 40 s，72℃30 s， 扩增39个循环，72℃延伸7 min。人VEGF、β-actin 引物由上海生工生物工程公司合成，VEGF上游引 物为5’-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG-3’，下游 引物为5’-TCACCGCCTCGGCTTGTCACATC-3’， 扩增产物片断长为576 bp。β-actin上游引物为5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物为5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，扩增产物片断 长为226 bp。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定， 紫外灯下拍照，根据各条带吸光度，采用GEL-Pro Analyzer软件分析VEGF mRNA的表达水平。 1.5 Western blot分析

取对数生长期的CNE-2、CNE-2/Neg-siRNA和 CNE-2/VEGF-siRNA细胞，消化接种于6孔板，待 90%~95%的细胞融合后继续培养24h再提取蛋白。 用Bradford法将所有蛋白调整至相同浓度性SDSPAGE 电泳，电转移法转至经甲醛处理的PVDF膜 中，封闭2 h加入一抗（兔抗人SHP-1、p53、Cyclin E 和Cyclin D1单克隆抗体），TBST漂洗40 min，HRP 标记的二抗孵育1 h漂洗45 min。暗室中行化学发光 显影扫描图、用凝胶图像处理系统分析各条带的灰 度值，并根据相对灰度值进行统计分析^{[5, 8]}。上述实验独立重复3次。

1.6 统计学方法

以SPSS13.0软件进行统计分析，所有计量资 料以x±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学 意义。 2 结果 2.1 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成率

3组细胞分别接受0、2、4、6、8、10 Gy单次 照射，培养2周后均有克隆形成，其克隆形成率见 表 1。CNE-2/VEGF-siRNA组克隆形成率较对照组 明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，CNE-2组 与CNE-2/Neg-siRNA组对比无明显差异。

表 1(Table 1)

表 1 三组细胞接受不同剂量照射后克隆形成率(x±s,%) Table 1 Cloning efficiency of three groups after receiving different doses of radiation(x±s,%)

表 1 三组细胞接受不同剂量照射后克隆形成率(x±s,%) Table 1 Cloning efficiency of three groups after receiving different doses of radiation(x±s,%)

计算出不同剂量下的细胞存活率，经单击 多靶模型拟合曲线显示，CNE-2组与CNE-2/NegsiRNA 组的放射生物学参数D₀、N、D_q和SF2值相 似，见表 2，而CNE-2/VEGF-siRNA组的上述参数 均降低；同时从生存曲线上观察到CNE-2/VEGFsiRNA 组的斜率较另二组明显增加，“肩宽”明显缩 小变窄，各个剂量点存活分数均低于CNE-2组和 CNE-2/Neg-siRNA组，而CNE-2组和CNE-2/NegsiRNA 组差异不明显，见图 1。

图 1 CNE细胞系不同剂量照射后的存活曲线 Figure 1 Cell survival curves of CNE cell lines after receiving different doses of radiation

表 2(Table 2)

表 2 3组细胞单击多靶模型及线性二次模型拟合的相关参数 Table 2 Radiobiological parameters from single hit multitarget model and linear-quadratic model in three groups

表 2 3组细胞单击多靶模型及线性二次模型拟合的相关参数 Table 2 Radiobiological parameters from single hit multitarget model and linear-quadratic model in three groups

通过流式细胞技术分析不同细胞组的细胞周 期和细胞凋亡的影响，三组细胞中G0/G1、G2/M 和M期相对含量见表 3。与CNE-2组、CNE-2/NegsiRNA 组相比，CNE-2/VEGF-siRNA组G0/G1其细 胞含量明显增加，而M期细胞明显减少。三组细 胞凋亡检测见图 2，三组之间无明显差别。

表 3(Table 3)

表 3 流式细胞技术分析三组细胞周期相对表达量（%） Table 3 Cell expression in different cell cycles detected by flow cytometry（%）

表 3 流式细胞技术分析三组细胞周期相对表达量（%） Table 3 Cell expression in different cell cycles detected by flow cytometry（%）

图 2 CNE细胞系照射后流失细胞检测细胞凋亡Figure 2 Cell apoptosis of CNE cell line measured by flow cytometry after receiving various doses of radiation

上述流式细胞技术细胞周期分布表明CNE-2/ VEGF-siRNA组细胞发生G1/S阻滞，因此选择参与 G1/S调控因子Cyclin D1、Cyclin E、p16和p53基因 探讨可能信号通路。在这4个基因中Cyclin D1的 灰度值在放疗后6、12和24 h进行性升高，并且差 异有统计学意义，其他基因变化差异无统计学意 义，见图 3。通过Western blot检测提示Cyclin D1在 照射后24 h明显升高，而Cyclin E和p53无明显变 化，见图 4。

*:P＜ 0.05 图 3 RT-PCR检测CNE-2细胞系中的Cyclin D1、Cyclin E、p16和p53的灰度值 Figure 3 The odds of gray value of Cyclin D1,Cyclin E ,p16,and p53 in different CNE-2 lines measured by RT-PCR

图 4 Western blot检测CNE-2细胞系中的Cyclin D1,p16,Cyclin E和p53照射后24 h的表达 Figure 4 Expression of Cyclin D1,p16,Cyclin E and p53 in CNE-2 cell line detected by Western blot after receiving irradiation for 24 h

放射抗拒是鼻咽癌治疗局部区域失败的原因 之一，其抗拒的发生机制目前仍不清楚，寻找增 加放射敏感度的方法是提高治愈率的途径之一。 用肿瘤细胞内在放射敏感度的生物标志来预测鼻 咽癌放疗的可治愈性是当前的研究热点。已有的 研究表明肿瘤细胞乏氧相关因子（如乏氧诱导因 子-1、血红素加氧酶1）、DNA损伤修复相关因子 （如DNA 依赖性蛋白激酶）、细胞增殖相关因子 （如增殖细胞核抗原、p53）、细胞凋亡相关因子 （如Bcl-2和s urvivin）、细胞周期调控相关基因 （如细胞周期素和细胞周期激酶等）与鼻咽癌的 放射敏感度密切相关^[3]。实际上，肿瘤细胞对电离 辐射反应呈现分子网络式的特点，网络通过相应 节点密切联系且相互调控^[3]，如与放射敏感度相关 的某些信号通路发生改变，则可能影响这些信号 通路活化及其相关基因的表达。本研究通过下调 VEGF的表达，探索VEGF参与鼻咽癌放射敏感度 的分子生物学机制。

血管内皮生长因子在肿瘤血管生成方面有重 要作用，有研究结果表明肿瘤组织的VEGF表达 水平与放射敏感度呈负相关[6-7]。对鼻咽癌、口咽 癌、口腔癌、肺癌、食管癌、脑胶质瘤和黑色素 瘤等的研究表明，阻滞VEGF的表达可增加射线对 肿瘤细胞的杀伤力，即增加放射敏感度^[7]。本研究 证实阻断VEGF表达提高了鼻咽癌的放射敏感度， 阻断鼻咽癌细胞VEGF的表达导致其癌细胞发生细 胞周期G₁/S阻滞。

细胞内存在一系列严密的调控机制确保细胞 周期严格按照时相转换有序进行。已发现的与细 胞周期调控有关的分子很多，主要包括细胞周期 蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞周期蛋白 依赖性激酶抑制因子。此外，细胞周期检验点在肿 瘤细胞和正常细胞中存在差异，细胞周期调控分子 在癌症发生、发展过程中均起着重要作用[8-9]。目 前研究表明细胞主要存在G1/S、S期和G2/M三个检 验点^[9]，本研究表明VEGF与放射敏感度的关系主 要是G1/S检验点。本研究中主要检测了参与G1/S细 胞周期调控相关的因子Cyclin D1、Cyclin E、p16 和p53基因，阻断VEGF表达后Cyclin D1在RNA和 蛋白质水平上均有不同程度的升高，而其他基因 或蛋白如Cyclin E、p16和p53基因则无明显差别， 因此提示VEGF参与鼻咽癌放射敏感度的调控与 Cyclin D1在RNA和蛋白质水平变化相关。

尽管本研究在RNA和蛋白水平上证实VEGF 参与鼻咽癌放射敏感度的调控过程，但是本研究 尚存在以下不足之处：（1）本研究仅为体外研 究，和体内的放射敏感度调节过程可能存在一定 差异，因此需进一步在临床上研究VEGF生物标 志物及VEGF抑制剂对鼻咽癌疗效的影响；（2） VEGF参与鼻咽癌的放射敏感度的调控通路可能有 多条，本研究仅仅探讨了VEGF与鼻咽癌细胞周期 的关系，但是否参与其他通途如血管生成、肿瘤 乏氧等尚需进一步探索；（3） 调控细胞周期的 机制也十分复杂，本研究的结果提示Cyclin D1是 VEGF调控鼻咽癌的放射敏感度的因素之一，但是 否还有其他分子生物学机制仍需进一步研究。

总之，本研究通过RNAi干扰技术阻断鼻咽癌 细胞系CNE-2的VEGF表达，表明鼻咽癌细胞中 VEGF的表达增加了其放射敏感度，可能通过细胞 周期调控蛋白Cyclin D1的细胞周期调控信号通路 发挥作用，并发生了细胞G1/S周期阻滞。研究结果 为如何减低鼻咽癌放疗的放射抗拒、增加放射敏 感度提供了一个参考。