脑胶质瘤是人类中枢神经系统中最常见的恶性 肿瘤，主要采取手术为主辅以放射及化学治疗的综 合治疗方案，但其预后并未得到明显改善。放化疗 抵抗和肿瘤复发仍是治疗效果不佳的主要原因^[1]。 目前关于胶质瘤多药耐药的研究较多，但具体分子 机制仍不清楚，是研究热点之一。本课题在前期建 立胶质瘤耐药细胞株的基础上，探讨p38MAPK信 号通路在脑胶质瘤细胞化疗耐药中的作用。 1 材料与方法 1.1 实验细胞及主要试剂

人脑恶性胶质瘤细胞系U251购于中国科学院上 海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。 U251/TMZ耐药细胞株由本实验室自行构建并保存 ^[2]。DMEM培养液及胰蛋白酶购自美国Gibico公司； 胎牛血清购自杭州四季青生物材料公司；DMSO 购自武汉天源生物技术公司。PVDF膜购自瑞典 Amersham公司；Bcl-2、TopoⅡ、MDR1抗体（兔来 源的多克隆）和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔（羊 抗鼠二抗）购自Santa Cruz公司；DAB试剂盒购自福 州迈新公司；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购自碧 云天生物技术公司；SB20358购自Alexis公司。 1.2 主要仪器

80 L细胞培养箱购自德国HERAENS公司； 超净工作台为苏州净化集团产品，CK-40倒置相 差显微镜及照相系统购自日本Olympus公司；电 子分析天平购自美国丹佛公司，恒温摇床为上海 振华公司产品；LS6500多功能液体闪烁计数仪为 Beckman Counlter公司产品，5301型真空干燥仪 由德国Eppendorf公司提供，高速台式离心购自 Hitachi公司，低温高速离心机购自Beckman公司。 HV3000多用电泳仪购自北京东方仪器厂，TS-1型 脱色摇床购自上海亚荣生化仪器厂。 1.3 细胞培养

将本实验室自行建立并保存的U251/TMZ细胞 复苏，将细胞悬液接种于培养瓶，置于体积分数 5%CO2，95%湿度条件的培养箱37℃条件下连续培 养。每2 d更换1次培养液，待细胞铺满瓶底约80% 以上时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化，1∶3传代。 1.4 p38MAPK信号通路的阻断

U251/TMZ耐药细胞在培养瓶中长至80%融合 时，换含1%血清培养液，继续培养24 h使细胞同 步化，后加SB203580（20 μM）预孵育1 h，设立 阴性对照组，两组中分别加入替莫唑胺作用，检 测细胞活性及相关耐药基因的表达变化。 1.5 MTT法检测细胞活性变化

将每孔1×10⁴个细胞接种于96孔板，37℃培养过 夜。按不同浓度替莫唑胺（0、1、2、4、8 μg/ml） 进行给药，并设未阻断空白对照组，各24个复孔。 避光孵育48 h，孵育结束前4 h加入5 μg/ml MTT 20 μl，4 h后弃孔内液，每孔加入150 μl DMSO溶液， 避光震荡10 min，分光光度计测490 nm处光吸收值 （A），计算细胞抑制率=(1－抑制组平均A值/细胞 空白对照组A值) ×100%。实验重复3次，取其均值。 1.6 Western blot检测相关耐药基因蛋白表达

收集8 μg/ml替莫唑胺作用48 h的细胞，提取 总蛋白，取蛋白20 μg以10%SDS-PAGE电泳分离， 浓缩胶电压50~80 V，分离胶80~100 V。PVDF转 膜，转膜条件为200 mA 60 min，丽春红染色，以 相应蛋白的抗体鉴定MDR1蛋白、TopoⅡ蛋白、 BCL-2蛋白，ECL增强试剂盒显色，GAPDH做对 照，将结果行凝胶图像分析。 1.7 统计学方法

收集并整理实验数据，运用Excel 2007处理 MTT的数据，用SPSS17.0统计软件包作统计学 处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。以 P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 细胞活性的变化

用特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK通路 后，不同浓度替莫唑胺作用48 h，MTT法检测未 阻断及阻断后U251/TMZ耐药细胞的活性，观察耐 药细胞化疗敏感度的变化。结果显示，阻断通路 后，不同浓度替莫唑胺作用下细胞的抑制率明显 低于未阻断组，两组之间比较差异有统计学意义 （P＜0.05），说明p38MAPK被阻断后，细胞的耐 药性有所增强，见图 1。

图 1 阻断P38MAPK通路后细胞活性的变化 Figure 1 Change of cell activity after p38MAPK signal pathway was blocked

我们检测了在阻断前后耐药相关基因MDR1、 Bcl-2、TopoⅡ在U251/TMZ耐药细胞中的表达变 化情况。结果显示，阻断后耐药细胞中Bcl-2、 MDR1的表达明显升高，TopoⅡ的表达明显降低， 见图 2A。与未阻断的耐药细胞相比较，差异有统 计学意义，见图 2B。提示p38MAPK信号通路的阻 断后细胞耐药性的变化，可能与耐药株中耐药相 关基因Bcl-2、TopoⅡ、MDR1的表达变化有关。

*:P＜0.05，Δ:P＜0.05，◊:P＜0.05 图 2 阻断P38MAPK通路后耐药相关基因表达变化 Figure 2 Changes of resistance-associated gene expression after P38MAPK signal pathway was blocked

胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性 肿瘤，约占颅内肿瘤的35.26%~60.96%^[3]，术后复 发率高，患者预后差。尽管目前普遍认为化疗可 使脑胶质瘤患者生存获益，但临床证实其延长生 存期的作用十分有限。研究胶质瘤的化疗耐药机 制是目前研究的热点之一。

丝裂原活化的蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPK) 是一组可被多种信号激 活的丝/苏氨酸激酶。研究证实，MAPK信号转 导通路存在于大多数细胞内，其作用过程涉及多 层次的细胞调节，对生理、病理刺激可作出不同 反应，同时其可将细胞外刺激信号转导至细胞核 内，并引起细胞增殖、分化、转化、凋亡等生物 学反应^[4]，目前已有诸多实验发现MAPK信号转导 通路可能参与肿瘤化疗耐药。Zhao等^[5]通过检测3 株人胰腺癌耐药细胞株发现，ERK的表达升高， 且使用ERK/MAPK通路阻断剂后，耐药细胞株对 化疗药物（氟尿嘧啶、阿霉素、吉西他滨）的敏 感度发生变化，因此推断ERK/MAPK通路参与了 胰腺癌细胞耐药过程，同时检测了磷酸化Bcl-2 的表达，结果表明ERK/MAPK通路可能是通过调 节Bcl-2而导致胰腺癌细胞耐药。Hernández Losa 等^[6]发现顺铂可持续、特异性激活多株癌细胞中 p38MAPK并引发细胞毒作用，而顺铂耐药的细胞 株相对于非耐药株在顺铂作用下p38活性明显减弱 或缺失，经p38特异性抑制剂SKF860002预处理的 肿瘤细胞在顺铂作用下表现出细胞活性增强，说 明p38MAPK受抑制可能是顺铂耐药的原因。在本 组实验中，我们使用特异性阻断剂阻断p38MAPK 信号通路后，胶质瘤耐药株的细胞耐药性明显增 强，与以上结论一致，说明p38MAPK信号通路参 与了胶质瘤化疗耐药的形成。

详细充分地了解肿瘤细胞多药耐药的机制， 是寻找有效的逆转肿瘤化疗多药耐药方法的必要 条件。目前研究普遍认为，由ABC转运子超家族 （ATP-binding cassette transporter superfamily） 的跨膜转运蛋白所介导的机制是导致多药耐药的 主要原因。在ABC转运子超家族中，对P糖蛋白 （P-glycoprotein，P-gp）的研究最多^[7]，但研究提 示MDR1在胶质瘤患者中的表达也并不十分常见， P-gp的高表达并不是胶质瘤MDR的唯一因素。但 我们在前期的实验中明显发现MDR1在胶质瘤耐药 细胞中的表达升高，说明MDR1可能与胶质瘤的耐 药相关^[2]，在本实验中，我们发现U251/TMZ耐药 细胞在p38MAPK信号通路阻断后，细胞耐药性增 强，同时伴随有MDR1表达的明显升高，进一步说 明MDR1可能参与了胶质瘤化疗耐药的形成。

拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）是一种重要的酶， 主要作用为控制DNA双链结构的切割和重组结合 而影响DNA拓扑，是很多抗肿瘤药物的靶蛋白。 TopoⅡ含量的高低与肿瘤细胞的耐药性密切相 关，被认为是人脑胶质瘤化疗耐药的重要原因之 一。已有很多研究证实原发胶质瘤的分级与Topo Ⅱα的表达呈明显正相关，即胶质瘤的级别越高， 其中TopoⅡα的表达越强。Uesaka等^[8]研究发现， 依托泊苷对成神经管细胞瘤的化疗具有良好的作 用，机制可能是其TopoⅡα与TopoⅡβ均有高表 达，提示TopoⅡ含量和活性的降低可能与肿瘤在 治疗过程的获得性耐药密切相关。本实验中也发 现，阻断p38MAPK信号通路后，TopoⅡ的表达含 量下降，胶质瘤耐药细胞的耐药性增强，研究结 果与以上结论一致。

Bcl-2在正常组织中的作用主要是保护正常细 胞免受毒物的侵害，保证细胞的存活。Bcl-2与化 疗耐药的关系也有所研究。Bcl-2的表达升高可 以导致肿瘤的化疗耐药性和肿瘤细胞的增殖，同 时，将Bcl-2基因转染到恶性胶质瘤细胞中可以导 致放疗和细胞毒性药物的效果明显降低^[9]。在本实 验中发现，细胞耐药性的升高明显伴有Bcl-2表达 的升高，说明Bcl-2与胶质瘤的耐药性明确相关。

总之，本文初步研究了p38MAPK信号通路在 脑胶质瘤细胞化疗耐药中的作用及相关机制，证 实p38MAPK信号通路的活化可明显提高胶质瘤耐 药细胞的化疗耐药性，提示我们p38MAPK信号通 路可作为一个作用靶点，为下一步寻找逆转胶质 瘤耐药策略提供理论依据。