甲状腺肿瘤是发病率最高的内分泌肿瘤，约 占所有新诊断肿瘤的1%，它的发生发展与环境和 遗传因素密切相关^[1]。妊娠期由于机体的激素水 平及个人情绪等因素波动较大，对甲状腺癌的发 生及发展都有重大影响^[2,3,4]。人绒毛膜促性腺激素 (hCG)是由胎盘绒毛组织分泌的一种糖蛋白激素。 在妊娠期，hCG水平成倍增加，是体内浓度变化 最大最明显的激素。邢艳等^[5]的研究发现hCG对卵 巢癌有明显促进作用，而Lopez等^[6]却发现纯化的 hCG能诱导乳腺癌的凋亡，其在不同肿瘤中完全 不同的作用引起了我们极大的兴趣和思考。hCG 对甲状腺癌是否有影响，目前仍没有定论，本研 究主要通过体外实验从细胞水平探寻人绒毛膜促 性腺激素对甲状腺乳头状癌细胞增殖活力及细胞 周期的影响，从而对临床处理妊娠期甲状腺癌提 供一定理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 主要试剂

人甲状腺乳头状癌细胞株IHH-4 来源于日本国家生物医学创新研究所（national institute of biomedical innovation,JCRB）；标准胎 牛血清(FBS)、RPMI 1640培养夜和DMEM培养夜 （美国Invitrogen公司)；细胞周期分析试剂盒（美 国BD公司）；人绒毛膜促性腺激素和MTT（美国 Sigma公司）。 1.1.2 细胞培养

人甲状腺乳头状癌细胞株IHH-4 复苏成功后，用含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、 50 u/ml青霉素、50 ug/ml链霉素的由RPMI 1640和 DMEM按1:1配置的培养夜中。所有的细胞均在37℃和5% CO₂及饱和湿度的条件下培养，每1~2天换 液，细胞铺满培养瓶后以0.25%胰蛋白酶-EDTA按 1:3消化传代，选用对数期生长的细胞进行实验 ^[7]。 1.2 实验方法 1.2.1 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)

MTT即 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮 唑溴盐，主要用来检测细胞的生长与活力。取对 数期生长的人甲状腺乳头状瘤细胞株IHH-4接种 于96孔板中，设置实验孔、对照孔及空白孔，每 组均设置5个复孔，待细胞贴壁后于含有不同浓度 的人绒毛膜促性腺激素的培养液中（10 mIU/ml、 100 mIU/ml、500 mIU/ml、 1 IU/ml、10 IU/ml、 100 IU/ml）培养24、48、72 h，加入MTT溶液后 再培养4 h，之后每孔加入二甲基亚砜（DMSO） 低速振荡10 min，用酶标仪（Multiskan MK3）设 定560 nm波长检测每孔OD值。舍弃差异较大的复 孔OD值，实验结果取各组复孔平均值^[6]。 1.2.2 流式细胞术检测细胞周期

将对数期生长 的IHH-4细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后予 以含不同浓度hCG (1、10、100 IU/ml)的培养液 中培养24、48、72 h后收集细胞，磷酸盐缓冲液 （PBS）洗两次后予以70%乙醇固定，4℃条件下 过夜后碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测细 胞周期并用CellQuest软件分析结果^[8]。 1.3 统计学方法

结果以x±s表示，采用统计软件SAS 9.3对数 据进行t检验、方差齐性检验、正态分布检验。 多组间采用随机单位组设计资料的方差分析(twoway ANOVA) ,各组内样本采用单因素方差分析 (ANOVA)，计量资料采用成组设计的t检验，P <0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 hCG对甲状腺乳头状癌细胞增殖活性的影响

培养24、48、72 h，组间有明显变化，IHH-4细 胞的增殖活力增加，差异有统计学意义（P<0.01）， 于不同浓度处理24~72 h后观察发现，于hCG浓度10 IU/ml、100 IU/ml处理的细胞具有明显的增殖活力， 与对照组相比差异有统计学意义，见图 1。

*:P<0.05,**:P<0.01 图1 hCG在不同浓度和不同时间对甲状腺乳头状癌细胞IHH-4增殖的影响 Figure 1 The proliferation activity of papillary thyroid carcinoma cell line IHH-4 influenced by hCG at different concentration and different time

应用流式细胞术检测在不同hCG浓度以及不 同作用时间下IHH-4细胞周期的变化情况，结果显 示在hCG的作用下S+G2M期的百分比有明显的增 加。与对照组相比，hCG浓度为100 IU/ml时细胞 周期改变最为显著，暴露于100 IU/ml hCG 48 h的 实验组S+G2M期的百分比为67.1%，显著高于未处 理对照组。而随着时间的延长，持续作用至72 h， 其效应逐渐减弱，见图 2。

**: P<0.01 图2 hCG在不同时间及浓度对甲状腺乳头状癌细胞IHH-4周期的影响 Figure 2 The cell cycle in papillary thyroid carcinoma cell line IHH-4 influenced by hCG in different concentration and different time

当hCG在1927年被首次发现以来，一直是作 为妊娠相关因子被人们所熟知的。正常人的hCG 水平应<0.1 ng/ml，在妊娠期hCG水平发生剧烈改 变，妊娠第4周hCG水平开始升高，第7周达3 278 ng/ml，第10周是最高峰，高达10 352 ng/ml，之后 开始下降，13周以后维持在2 000 ng/ml左右^[9]。高 浓度的hCG对维持妊娠有重要作用。

但hCG与肿瘤有着错综复杂的关系，许多研究 均证实hCG对多种肿瘤细胞的生长有促进作用。Gillott等^[10]研究表明hCG能促进膀胱癌细胞的增 殖，具有剂量依赖性，而与抗β-hCG的抗血清共 同孵育会拮抗这些作用，Butler等^[11]认为hCG对膀 胱癌细胞的作用主要是通过抑制细胞凋亡而达到, 且β-hCG能抑制TGFbeta1诱导的凋亡，β-hCG对 宫颈癌细胞也有一定的凋亡抑制作用^[12]。但hCG 对不同肿瘤的作用却不尽相同，Lopez等^[6]发现人 绒毛膜促性腺激素能诱导乳腺癌细胞的凋亡，在 裸鼠成瘤中予以hCG处理组的瘤体可见37%的凋 亡率，远远高于对照组14%，处理6天后可看到凋 亡小体形成及肿瘤完全坏死，通过细胞增殖活力 实验还发现hCG能降低多种体外培养乳腺癌细胞系的活力，部分与表达hcg/LH受体有关。hCG还 能促进血管生成和肿瘤细胞的转移，近年有学者 报道^[13]hCG与血管内皮生长因子VEGF之间有交互 作用，在子宫内膜的血管生成过程中有一定的作 用，通过免疫组织化学看到表达β-hCG的宫颈癌组 织具有更多的新生血管^[12]。β-hCG还能调节E-钙黏 蛋白，E-钙黏蛋白是上皮细胞之间重要的连接蛋 白，Wu等^[14]发现β-hCG能下调E-钙黏蛋白，从而 促进膀胱癌细胞的浸润和转移。

有些肿瘤细胞能自行分泌β-hCG，在肺癌、膀 胱癌、乳腺癌、口腔癌、胃癌中均有表达，被认为 与不良预后和较差的生存率有关，因此常被作为一 种恶性肿瘤标志物^[15]。有些甲状腺乳头状癌同样也 能分泌hCG,Sakaguchi等^[16]研究甲状腺乳头状癌细 胞系B-CPAP异位分泌的hCG对小鼠甲状腺细胞系 FRTL-5的作用，发现提纯的异位hCG与标准hCG的 作用一样都能促进环磷酸腺苷cAMP的积累和3H胸 苷进入细胞，从而促进甲状腺细胞的增值，具有剂 量依赖性，而抗β-hCG抗体能拮抗这些作用。学者 们早前已经开始研制基于异位β-hCG的肿瘤疫苗， 经过这么多年，已有了不少更新和进展，现在有选 择性hCG疫苗，如抗β-hCG CTP疫苗、hCG GA68 突变型疫苗及人β-hCG抗树突状细胞相关抗体疫 苗，这些疫苗许多已经进行过Ⅰ期甚至Ⅱ期临床试 验^[15]，但并非所有肿瘤细胞都表达β-hCG，有些正 常组织细胞也能低表达β-hCG，故基于此的基因治 疗仍有许多需要考虑和改进的地方。

早在90年代学者们已经开始研究hCG与甲状 腺的关系了，但他们之间具体关系却并不明确， 也较少有人研究hCG对甲状腺肿瘤细胞本身的作 用，Yoshimura等^[17]认为 hCG具有与TSH相似的 调节碘代谢作用，能竞争性与促甲状腺激素受体 TSHR结合继而刺激甲状腺细胞生长，具有剂量依 赖性，且适宜浓度与正常妊娠期母体内hCG的浓 度相似。但是hCG对甲状腺癌的作用目前仍有争 论，在丹麦一个大型的促生育剂队列研究中，发 现hCG与甲状腺癌的发生并无显著的相关性^[18]。

本研究发现，高浓度的hCG能显著促进甲状腺 乳头状癌细胞的增殖活性，在浓度为10及100 IU/ml 时最为明显，细胞周期的结果也证实了这一点。在 MTT实验中，我们看到在浓度为100 IU/ml的hCG分 别作用24、48、72 h后增殖活力明显增加，但是细 胞周期的结果示48 h周期最为活跃，到72 h有所减 低，这之间的矛盾可能与培养细胞的营养环境改变 有关，72 h处于增殖期的细胞比例会有所下降。

本文通过体外细胞学实验，证实hCG对甲状 腺乳头状癌细胞的生长有明显促进作用，对细胞 周期有明显促进，但仍需要更进一步的实验来探 讨其作用途径及相关分子水平变化以及不同种类 的hCG对甲状腺癌细胞的作用和相互关系。对于 临床工作者来说，更需要重视妊娠期甲状腺癌患 者，对其密切随访，制定更为有效的治疗方法， 以减少肿瘤的复发和转移。