急性白血病（acute leukemia，AL）是常见的恶 性肿瘤，JAK/STAT（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription signaling pathway）途径 的激活与白血病细胞增殖分化有关，SHP-1是JAK/ STAT信号转导通路的负调控机制之一。SHP-1基因的表达缺失可归因于SHP-1的突变、启动区的甲 基化或SHP-1蛋白合成转录后调节。研究证实，淋 巴瘤和白血病细胞系中存在SHP-1基因表达缺失及 其启动子甲基化^[1]，5-aza-CdR能诱导这些细胞系 SHP-1基因表达，并抑制肿瘤细胞增殖^[2]。As₂O₃ 具 有杀伤白血病细胞、促进白血病细胞凋亡和诱导 细胞分化三重作用，并发挥去甲基化的作用^[3]。本 实验以白血病细胞株U937为研究对象，通过实时 定量PCR法，从mRNA水平研究了应用去甲基化 药物5-aza-CdR和As₂O₃ 后，SHP-1、JAK3、TYK2 基因的表达情况，分析了SHP-1基因的表达缺失 的原因及对JAK/STAT通路的影响，为进一步探讨 SHP-1基因和JAK家族基因在白血病发病中的作用 奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料

白血病细胞株U937，为河北医科大学第二医 院血液病研究所试验室保留株。RPMI 1640培养 液和新生胎牛血均购自Hyclone公司。5-aza-CdR 购自美国Sigma公司，用10% RPMI 1640培养液 配成4 mol/L储备液，-20℃保存，稀释终浓度为 200 μmol/L。As₂O₃ （三氧化二砷，ATO）购自哈 尔滨伊达药业有限公司，应用浓度为500 μmol/L。 TRIzol Reagent购自美国Invitrogen公司。SYBR GreenⅠ购自上海基康生物技术公司。SHP-1上游 引物：5′-GCC TGG ACT GTG ACA TTG AC-3′， 下游引物：5′-ATG TTC CCG TAC TCC GAC TC-3′。JAK3上游引物：5′-CCA CGG TCT GGG AAG TGT TTA G-3′，下游引物：5′-ACG AAT GAC GGC TCG GAA G-3′。TYK2上游引物： 5′-TCA CTG AGT TGC TGG AAC GAG G-3′，下游 引物：5′-CGA AGG TTG GGC GAA AGG AC-3′。 β-actin上游引物：5′-TCA TCA CCA TTG GCA ATG AG-3′，下游引物：5′-CAC TGT GTT GGC GTA CAG GT-3′。引物由上海生工基因技术有限公司合 成，SHP-1的扩增片断长度187 bp，JAK3的扩增 片断长度188 bp，TYK2的扩增片断长度117 bp， β-actin的扩增片断长度155 bp。 1.2 细胞培养

U937细胞悬浮培养于含10%热灭活（56℃， 30 min）的新生胎牛血清、青霉素100 u/ml、链霉 素100 μg/ml的RPMI 1640培养液中。培养条件为 37℃、5%CO₂饱和湿度，隔天换液传代一次。取 对数生长期的细胞用于实验。 1.3 药物处理

将对数生长期的细胞转入细胞培养板，每孔1 ×10⁶cells/ml。5-aza-CdR浓度为0.5、1、2 μmol/L， As₂O₃ 的浓度为1、2.5、5 μmol/L，As₂O₃ 1 μmol/L+ 5-aza-CdR 0.5 μmol/L（低浓度组）、As₂O₃ 2.5 μmol/L+5-aza-CdR 1 μmol/L（中浓度组） 、As₂O₃ 5 μmol/L+5-aza-CdR 2 μmol/L（高浓度组） ^[2]及空白对照组。细胞和药物在37℃、5%CO₂饱和湿度 条件下孵育24、48、72 h后收获并洗涤。 1.4 荧光实时定量PCR（RQ-PCR）检测SHP-1、 JAK3、TYK2的基因表达

Trizol提取细胞总RNA，在紫外透射仪上显示 有28S、18S（部分可见到5S）两条rRNA条带，说 明提取的RNA完整。紫外分光光度计定量。反转 录反应体系20 μl，包括细胞总RNA 2 μg，50 u/μl Rnasin 1 μl，500 μg/ml随机引物1 μl，10 mM dNTP 2 μl，5×反转录反应缓冲液4 μl，M-MLV反转录酶 200 u，余用DEPC水补足至20 μl。反应条件为37℃ 中反应60 min，95℃反应5 min后终止反应。cDNA 在-80℃保存或进行PCR扩增。

RQ-PCR反应总反应体系25 μl，包括cDNA 1.5 μl，10 pmol/μl 上、下游引物各1 μl，dNTP 5 mM 0.8 μl，10×buffer 2.5 μl，MgCl2 25 mM 1.5 μl，Taq酶3 u/μl 0.5 μl，20×SYBR Green I 1 μl， 余用DEPC水补足25 μl。SHP-1的扩增条件：94℃ 变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，35个循 环。最后72℃延伸10 min。JAK3的扩增条件： 94℃变性45 s，60℃退火45s，72℃延伸60s，35个 循环。最后72℃延伸10min。TYK2的扩增条件： 94℃变性45s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，35个 循环。最后72℃延伸10 min。β-actin的扩增条件： 94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸60 s，35个 循环。最后72℃延伸10 min。 1.5 PCR产物的相对定量分析

通 过 标 准 曲 线 对 检 测 样 品 的 目 的 基 因 （SHP-1、JAK3、TYK2）及管家基因（β-actin） 进行定量，然后用下列公式计算，求得相对值即 为相对表达量。 相对值=2^-ΔΔCt，ΔCt=Ct₁-Ct₂，Ct₁：处理样品待 测基因的临界循环数，Ct₂：处理样品管家基因的 临界循环数。 1.6 统计学方法

组间比较采用多样本均数比较的方差分析。 采用配对t检验分析单用药与合用药对基因表达的 影响。采用直线回归分析，探讨SHP-1对JAK3、TYK2的影响。所有数据用SPSS.V13.0统计软件分 析处理，P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 SHP-1基因在U937细胞中的表达

单独应用As₂O₃ 和5-aza-CdR以及两药合用时， 随着药物浓度的增加和作用时间的延长，SHP-1的 表达水平升高，与未用药的对照组以及各组间两 两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。合用药 均比单独用药时的表达水平升高，差异有统计学 意义（P<0.05），见图 1，表 1、2。

1:As2O3 low;2:As2O3 mid;3:3:As2O3 high;4:5-aza-CdR low;5:5-azaCdR mid;6:5-aza-CdR high;7:As2O3 + 5-aza-CdR low;8:As2O3 + 5-azaCdR mid;9:As2O3 + 5-aza-CdR high 图1 SHP-1基因在U937细胞中的表达 Figure 1 SHP-1 mRNA expression in U937 cells

表 1(Table 1)

表 1 单用As2O3 及联合用药处理后SHP-1基因在U937细胞中表达比较 Table 1 Comparison of SHP-1 gene expression in U937 cells treated with As2O3 and the combination Notes: ＊:P<0.05, compared with 1 μmol/L；※:P<0.05, compared with 2.5 μmol/L；☆:P<0.05, compared with 5 μmol/L; - :do not need to compare

表 1 单用As2O3 及联合用药处理后SHP-1基因在U937细胞中表达比较 Table 1 Comparison of SHP-1 gene expression in U937 cells treated with As2O3 and the combination

表 2(Table 2)

表 2 单用5-aza-CdR及联合用药处理后SHP-1基因在U937细胞中的表达比较 Table 2 Comparison of SHP-1 gene expression in U937 cells treated with 5-aza-CdR and the combination Notes：＊:P<0.05,compared with 0.5 μmol/L；※:P<0.05,compared with 1 μmol/L；☆:P<0.05,compared with 2 μmol/L; - :do not need to compare

表 2 单用5-aza-CdR及联合用药处理后SHP-1基因在U937细胞中的表达比较 Table 2 Comparison of SHP-1 gene expression in U937 cells treated with 5-aza-CdR and the combination

随着药物浓度的增加和作用时间的延长， J A K 3的表达水平下降，与未用药的对照组比 较差异均有统计学意义（P<0.05）。除中浓度 （2.5 μmol/L）时，48与72 h差异无统计学意义 （P=0.111）外，其余各浓度在各时段的表达变 化经两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。 在三个时段（24、48、72 h）内低、中、高浓度 间的表达变化经两两比较，差异均有统计学意义 （P<0.05），见图 2、表 3。

1:As2O3 low;2:As2O3 mid;3:3:As2O3 high;4:5-aza-CdR low;5:5-azaCdR mid;6:5-aza-CdR high;7:As2O3 + 5-aza-CdR low;8:As2O3 + 5-azaCdR mid;9:As2O3 + 5-aza-CdR high 图2 JAK3基因在U937细胞中的表达 Figure 2 JAK3 mRNA expression in U937 cells

表 3(Table 3)

表 3 单用As2O3 及联合用药处理后JAK3基因在U937细胞中的表达比较 Table 3 Comparison of JAK3 gene expression in U937 cells treated with As2O3 and the combination Notes:＊:P<0.05, compared with 1 μmol/L；※:P<0.05, compared with 2.5 μmol/L；☆:P<0.05,compared with 5 μmol/L；＃:P<0.05, compared with 48 h; - :do not need to compare

表 3 单用As2O3 及联合用药处理后JAK3基因在U937细胞中的表达比较 Table 3 Comparison of JAK3 gene expression in U937 cells treated with As2O3 and the combination

随着药物浓度的增加和作用时间的延长， JAK3的表达水平下降，与未用药的对照组比 较差异均有统计学意义（P<0.05）。除低浓度 （0.5 μmol/L）时，空白组和24 h差异无统计学 意义（P=0.052），48和72 h差异无统计学意义 （P=0.235）；中浓度（1 μmol/L），48和72 h差异无统计学意义（P=0.120）外，其余各浓度在各 时段的表达变化经两两比较差异均有统计学意义 （P<0.05）。在三个时段（24、48、72 h）内， 低、中、高浓度间的表达变化经两两比较，差异 均有统计学意义（P<0.05），见图 2、表 4。

表 4(Table 4)

表 4 单用5-aza-CdR及联合用药处理后JAK3基因在U937细胞中的表达 Table 4 Comparison of JAK3 gene expression in U937 cells treated with 5-aza-CdR and the combination Notes:＊:P<0.05,compared with 0.5 μmol/L；※:P<0.05, compared with 1 μmol/L；☆:P<0.05, compared with 2 μmol/L；＃:P<0.05, compared with 0 h;◎ :P<0.05, compared with 48 h；＆:P<0.05 compared with 48 h；- :do not need to compare

表 4 单用5-aza-CdR及联合用药处理后JAK3基因在U937细胞中的表达 Table 4 Comparison of JAK3 gene expression in U937 cells treated with 5-aza-CdR and the combination

随着药物浓度的增加和作用时间的延长， JAK3的表达水平下降，与未用药的对照组以 及各组之间两两比较，差异均有统计学意义 （P<0.05），合用药均比单用药时的表达水平下 降，差异有统计学意义（P<0.05）。 2.3 TYK2基因在U937细胞中的表达

单独应用As₂O₃ 和5- aza- CdR时以及两药合 用时，随着药物浓度的增加和作用时间的延 长，TYK2的表达水平降低，与未用药的对照 组，以及各组间两两比较差异均有统计学意义 （P<0.05）。合用药均比单独用药时的表达水平 降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图 3，表 5、6。

1:As2O3 low;2:As2O3 mid;3:3:As2O3 high;4:5-aza-CdR low;5:5-azaCdR mid;6:5-aza-CdR high;7:As2O3 + 5-aza-CdR low;8:As2O3 + 5-azaCdR mid;9:As2O3 + 5-aza-CdR high 图3 TYK2基因在U937细胞中的表达 Figure 3 TYK2 mRNA expression in U937 cells

表 5(Table 5)

表 5 单用As2O3 及联合用药处理后JAK3基因在U937细胞中的表达比较 Table 5 Comparison of TYK2 gene expressions in U937 cells after As2O3 alone and the combined treatment Notes:＊:P<0.05,compared with 1 μmol/L；※:P<0.05,compared with 2.5 μmol/L；☆:P<0.05,compared with 5 μmol/L；- :do not need to compare

表 5 单用As2O3 及联合用药处理后JAK3基因在U937细胞中的表达比较 Table 5 Comparison of TYK2 gene expressions in U937 cells after As2O3 alone and the combined treatment

表 6(Table 6)

表 6 单用5-aza-CdR及联合用药处理后TYK2基因在U937细胞中的表达的比较 Table 6 Comparison of TYK2 gene expressions in U937 cells treated with 5-aza-CdR alone and the combination Notes:＊:P<0.05 compared with 0.5 μmol/L；※:P<0.05 compared with 1μmol/L；☆:P<0.05 compared with 2 μmol/L

表 6 单用5-aza-CdR及联合用药处理后TYK2基因在U937细胞中的表达的比较 Table 6 Comparison of TYK2 gene expressions in U937 cells treated with 5-aza-CdR alone and the combination

通过对As₂O₃ 和5-aza-CdR作用于U937细胞株 后基因表达做直线回归分析后，可以看出，直线 回归方程均有意义(P=0)，JAK3和TYK2的基因 表达量同药物作用时间及浓度呈线性相关，呈负 相关，随着作用时间的延长和药物浓度的增加， JAK3和TYK2的基因表达量下降(回归系数b<0)。 在三种浓度分别作用下，JAK3的下降程度均大于 TYK2的下降程度(｜bJAK3｜>｜bTYK2｜)，但在三 个药物作用时间段中，仅48 h时TYK2的下降程度 大于JAK3的下降程度(｜bTYK2｜>｜bJAK3｜)，见表 7、8。

表 7(Table 7)

表 7 相同浓度下TYK2，JAK3基因在U937细胞中的表达 变化的回归系数比较 Table 7 Comparison of regression coefficients of TYK2, JAK3 expression changes in U937 cells under the same concentration of drugs Notes:b: regression coefficients;P<0.05 linear regression equation was established

表 7 相同浓度下TYK2，JAK3基因在U937细胞中的表达变化的回归系数比较 Table 7 Comparison of regression coefficients of TYK2, JAK3 expression changes in U937 cells under the same concentration of drugs

表 8(Table 8)

表 8 相同处理时间后TYK2，JAK3基因在U937细胞中的表达变化的回归系数比较 Table 8 Comparison of regression coefficients of TYK2, JAK3 expression changes in U937 cells with the same treatment time Notes:b:regression coefficients;P<0.05:linear regression equation was established

表 8 相同处理时间后TYK2，JAK3基因在U937细胞中的表达变化的回归系数比较 Table 8 Comparison of regression coefficients of TYK2, JAK3 expression changes in U937 cells with the same treatment time

基因启动子区域CpG岛的高度甲基化是白血 病（leukemia）等血液系统恶性肿瘤的一种发病机 制，大概有90%的血液系统恶性肿瘤都会至少有 一个基因高度甲基化。DNA高度甲基化成为髓系 白血病的重要致病机制^[4]。SHP-1主要表达于造血 细胞，被称为造血细胞磷酸酶（hematopoietic cell phosphatase，HCP），在信号转导中主要起负调 控作用，抑制细胞增殖^[5]与肿瘤的形成及生长呈负 相关。韩颖等^[6]研究发现，SHP-1的低表达或不表 达与AL的发病密切相关。JAK ^[7]是一种蛋白酪氨 酸激酶（PTK），迄今为止共发现4种家族成员： JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。除了JAK3外，其 余3种成员广泛分布于多种组织细胞中。而JAK3却 仅局限于白细胞中，在活化的T细胞、B细胞和单 核细胞中有高水平的表达^[8]。SHP-1主要通过去除 JAKs蛋白磷酸化对JAKs进行调解，也可加速JAKs 蛋白的降解而下调JAK/STAT途径^[9]。

5-aza-CdR是一种甲基化抑制剂，苏庸春等^[10] 研究发现5-aza-CdR作用于肿瘤细胞的主要机制是 通过其去甲基化作用，重新激活了那些由于DNA 过度甲基化而受到抑制的抑癌基因或多种细胞调控 基因，从而使细胞向终末分化、凋亡或衰老，并促 进细胞凋亡、抑制细胞增殖。As₂O₃ 主要用于急性 早幼粒细胞白血病（APL）、骨髓增生异常综合征 等恶性血液病的诱导分化治疗，取得较好疗效。沈 松菲等^[11]研究发现As₂O₃ 可诱导Jurkat细胞中异常甲 基化的hdpr1基因去甲基化并使其恢复表达。

本实验采用实时定量PCR技术，检测到白血 病细胞株U937中SHP-1基因低表达，JAK3、TYK2 高表达。在应用了甲基化抑制剂5-aza-CdR与As₂O₃ 后，U937细胞的增殖受到不同程度的抑制，有 剂量和时间依赖性。单独应用这两种药物后，都 可以使原来低表达的SHP-1表达升高，并且随着 药物浓度的增高和作用时间的延长其表达量也增 加，而JAK3、TYK2基因表达也随之下降，说明 基因的表达水平与药物的作用时间和浓度有关。 联合应用这两种药物，发现SHP-1基因表达水平的 升高和JAK3、TYK2基因表达水平的下降幅度， 比单独应用时更为显著。杨琳等^[12]通过对63例成 人急性髓系白血病患者的SHP-1及JAKs基因表达 研究发现，在mRNA水平，SHP-1表达与JAK1、 JAK3呈负相关。故推测，SHP-1基因的重新表达 与它发生去甲基化有关系，对JAK/STAT通路发挥了的负调控作用，使JAK3、TYK2基因的表达水 平下降。较长的作用时间，较高的药物浓度以及 两种药物联合后均可以加强其去甲基化的作用。 在JAK/STAT通路中，可能适合的浓度更能加强 SHP-1对JAK3的负调控作用。

综上所述，异常激活JAK/STAT信号转导通 路，可导致白血病的发生。JAK3、TYK2基因 的表达上调，可以正性激活JAK/STAT信号转导 通路。JAK3、TYK2、SHP-1都参与了白血病的 发病。SHP-1在白血病的发病中起着负性调节作 用。JAK3、TYK2在白血病的发病中起着正性调 节作用，它的高表达促进白血病的发生。As₂O₃ 和 5-aza-CdR对U937细胞株中抑癌基因的去甲基化作 用为我们提供了用去甲基化药物治疗肿瘤的一种 新思路。同时，SHP-1基因的重新表达、JAK3、 TYK2的降低表达，进一步说明了SHP-1在白血病 中发挥着重要的负调节功能。