microRNA-205(miR-205)是一种非编码微小 RNA，国内外研究表明，miR-205与肿瘤的发生、 侵袭、转移等密切相关^[1,2,3]，大多数肿瘤中表达水 平下降。肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma cell,ACC）是一种临床罕见的恶性肿瘤，发病机 制特别是分子水平的机制仍旧模糊，早期诊断十 分困难^[4]。治疗上仍然以手术治疗为主，缺乏有效 的药物治疗，术后复发率高，预后差^[5]。ACC对化 疗药物不敏感，miR-205可促进肿瘤细胞的凋亡， 但是否能加强ACC对化疗药物的敏感度尚未见报道。我们前期研究发现肾上腺皮质癌中miR-205表达 水平较肾上腺皮质腺瘤及正常肾上腺皮质组织低， 并且成功构建了miR-205过表达的稳定细胞株^[6] ，为本研究提供了重要的实验材料。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂

转染 pcDNA3.1 (+) -miR-205细胞及转染 pcDNA3.1(+) SW-13细胞由吴义高等成功构建并 验证^[6]，冻存于广州军区总医院实验科。Cisplatin （简称CDDP，购自美国Sigma公司），H33342及 CCK-8（日本同仁公司），AnnexinV-FITC/PI(美 国Biovision公司)，Guava NexinR凋亡检测试剂 （美国Millipore公司），单抗Bax、Bcl-2(美国BD 公司)，多抗Caspase-9、单抗β-actin（美国CST公 司），反转录试剂盒、荧光染料SYBR Green（瑞 士罗氏公司），L-15培养液（杭州吉诺公司）， 胎牛血清（美国Gib c o公司），DMS O（美国 Millipore公司）。 1.2 细胞及培养方法

设立转染 pcDNA3.1(+)的SW-13细胞为对照 组，转染pcDNA3.1 (+) -miR-205的SW-13细胞为 实验组。两组均用含10%胎牛血清的L-15培养液， 37℃，无CO₂培养。每3~5天传代一次，传代2~3 次细胞状态趋于稳定，取对数生长期细胞进行实 验。CDDP试剂用DMSO溶解，并配制浓度为10 mg/ml的母液，-20℃保存备用。 1.3 CCK-8法测定CDDP对细胞抑制率

将培养的SW-13细胞制备成浓度为5×10⁴/ml 的细胞悬液，接种于2块96孔板中，每孔体积为 100 μl。接种8~12 h后，按分组加入新鲜配制的含 有CDDP的培养液并避光培养。分为6组，分别为 DMSO溶剂组、CDDP5 μg/ml组、CDDP10 μg/ml 组、CDDP20 μg/ml组、CDDP30 μg/ml组、CDDP 40 μg/ml组，每组均设10个复孔。加药后48 h进 行CCK-8法检测，酶标仪450 nm波长测定各孔OD 值。 1.4 H33342、AnnexinV-FITC/PI染色

制备细胞爬片，按DMSO溶剂组、CDDP20 μg/ml组、CDDP30 μg/ml组加药，继续培养48 h。 倒置显微镜拍照后参照H33342及AnnexinV-FITC/ PI荧光说明书进行染色，荧光显微镜下观察。 1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

按DMSO溶剂组、CDDP20 μg/ml组、CDDP 30 μg/ml组进行处理后收集细胞，按Guava NexinR 凋亡检测试剂盒说明书进行染色。每孔加入预混 试剂避光孵育20 min后进行流式细胞检测。实验重 复3次，结果取其平均值。 1.6 Western blot检测蛋白表达

不同浓度CDDP作用48 h后，收集细胞并提 取细胞总蛋白。用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋 白转移到PVDF膜上，并用含5%脱脂奶粉的TBST 摇床封闭1 h，加入一抗稀释液（Bax、Bcl-2、 Caspase-9浓度分别为1:500、1:500、1:2 000）4℃ 孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP 标记的二抗，37℃孵育1 h。洗膜4次，每次10 min 后进行ECL显色并曝光。 1.7 QPCR检测mRNA水平

分别提取未转染、转染pcDNA3.1 (+)及转染 pcDNA3.1 (+) -miR-205细胞的总RNA，并反转 录合成cDNA，PCR条件：预变性 95℃ 2 min，两 步法95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。E2F1-： 上游引物：5’-CGTGGACTCTTCGGAGAACTTT -3’，下游引物:5’-ACCTCCTGGGATGGGGTCTT-3 ’ ; V E G F - A： 上 游 引 物 ：5 ’ - G G A G G G C A G A A T C A T C A C G A A G - 3 ’ ,下 游 引 物:5’-GAAGATGTACTCGATCTCATCAGGG-3’;β-actin：上游引物：5’-GGGAAATCGTGCGTGACA TTAAGG-3’; 下游引物：5’-CAGGAAGGAAGGCT GGAAGAGTC-3’。以β-actin作为内参，以2^-△△CT 法进行相对定量分析。 1.8 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量数 据用均数±标准差（x±s）表示，两个样本均数之间 的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 miR-205对细胞的CDDP药物敏感度的影响

实验组0、5、10、20、30、40 μg/mlCDDP对 细胞的生长抑制率分别为0、（14.58±0.75）%、 （41.02±1.02）%、（61.44±1.2）%、（72.00± 0.85）%、（80.72±1.3）%；对照组上述浓度细 胞抑制率分别为：0、（9.84±1.05）%、（22.70± 1.68）%、（43.48±1.27）%、（65.87±0.86）%、 （78.34±0.94）%。实验组的细胞对CDDP的敏感 度明显高于对照组（P＜0.05），见图 1。

图1 miR-205对肾上腺皮质癌细胞CDDP药物敏感度的影响 Figure 1 Effect of miR-205 on drug sensitivity of adrenocortical carcinoma cells to CDDP

H33342染色及AnnexinV-FITC/PI染色均可见 实验组每高倍镜视野细胞凋亡率明显高于对照 组。浓度为0、20、30 μg/ml CDDP作用下，荧光显微镜观察两组的细胞凋亡情况，见图 2A。在上 述三个浓度CDDP作用下，流式细胞仪检测早期 凋亡率，对照组和实验组凋亡率分别为：（1.88 ±0.22）%和（2.66±0.45）%、（6.04±0.78）%和 （11.74±1.15）%、（15.06±1.36）%和（24.62± 2.01）%。提示在不同浓度的CDDP诱导下，实验 组凋亡率明显高于对照组，见图 2B、2C。

A,B:effect of miR-205 on apoptosis of SW-13 cells detected by flow cytometry; C: nuclei stained with H33324 and FITC/PI（×200） 图2 miR-205对CDDP诱导肾上腺皮质癌细胞凋亡的影响 Figure 2 Effect of miR-205 on CDDP-induced cell apoptosis of adrenocortical carcinoma

在浓度分别为0、20、30 μg/ml CDDP作用下， 实验组促凋亡蛋白Bax和Caspase-9表达水平较对照 组明显升高，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平明显 降低，见图 3。

*:P＜0.05, **:P＜0.01 compared with pcDNA3.1(+) group 图3 miR-205对CDDP作用后相关蛋白表达水平的影响 Figure 3 Effects of miR-205 on the expression of apoptosis-related proteins induced by CDDP

m i R - 205实验组与对照组相比，E2F1、 VEGF- A 相对表达水平分别为（0.35±0.045） 倍、（0.21 ± 0.062）倍，显著低于对照组（P＜0.01）。 3 讨论

肾上腺皮质癌是一种临床罕见的恶性肿瘤， 每年发病率约1~2/100万,但其恶性程度高、进展 快、预后差，严重威胁患者生命，早期诊断十分 困难，甚至术后病理也不容易诊断^[7,8]。目前手术 切除肿瘤是国内外治疗ACC的首选方法，也是改 善患者生存期最可靠的手段，一旦发现本病，应 尽早行手术切除。

ACC对化疗药物不敏感，缺乏有效药物治 疗，如何改善其化疗药物敏感度是治疗ACC的一 大难题。CDDP是治疗多种恶性肿瘤的最常用和最 有效的化疗药物之一^[9]，也用于ACC患者的化疗。 但化疗的效果仍然不令人满意，提高化疗药物效 率也是众多学者研究的方向。

发现非编码基因及其作用规律是肿瘤学领域 一个重要的成就，研究表明miRNA表达谱在不 同肿瘤内表达是不同的。micro RNAs是一种长度 仅20~24 核苷酸的非编码RNA，其作用机制是通 过碱基配对来靶定某种mRNA的特定部位从而调 节这种蛋白的表达。将近30%的基因表达是通过 miRNAs在转录后水平来调节的^[10,11]。miRNA-205 是一种高度保守的miRNA，它可以抑制肿瘤的发 生、发展，也可以促进肿瘤的形成，至于是以抑 癌基因存在还是癌基因，取决于它所调控的下游 靶基因以及肿瘤的类型^[12]。

我们前期研究表明miRNA在ACC中为低表达。构建了真核表达载体p cDNA3 .1 (+) - m iR - 205，通过重组质粒转染至肾上腺皮质 癌S W- 1 3细胞株中，后期实时定量P C R表明 pcDNA3.1(+) -miR-205在SW-13中稳定转染。本 研究将选用转染pcDNA3.1(+) -miR-205和转染 pcDNA3.1(+)的SW-13细胞进行试验，分别为实 验组和对照组。在不同浓度的CDDP作用下，实验 组的细胞生长抑制率及凋亡率明显高于对照组， 其凋亡相关蛋白Bax、Caspase-9表达升高，抗凋 亡蛋白Bcl-2表达下降，表明miRNA-205可以改善 SW-13对CDDP的敏感度。肾上腺皮质癌中E2F1 和VEGF-A表达水平较肾上腺皮质腺瘤及瘤旁正 常组织明显升高。肿瘤的生长和存活依赖血管提 供的养分，VEGF可促进肿瘤细胞的生长、增殖及 迁移，在肿瘤新生血管中起着至关重要的作用。 VEGF-A是属于血管内皮生长因子的重要成员， 是目前研究最多应用最广的血管内皮生长因子， VEGF-A可促进肿瘤细胞的增殖，抑制细胞凋亡。 研究发现E2F1与VEGF- A间存在重要的关系， VEGF-A可通过作用转录因子E2F1来促进细胞增 殖生长，同样E2F1可以下调VEGF-A启动子的活 性^[13,14]。qPCR结果显示miRNA-205实验组E2F1、 VEGF-A水平较对照组明显降低，在众多肿瘤的研 究^[14,15]中发现VEGF-A对E2F1的调节作用占优势， 与本实验的发现相符，但具体的通路还需深层次 的探索。故从研究结果推测：miRNA-205可直接 或间接下调肾上腺皮质癌细胞内E2F1及VEGF-A的 表达，从而促进肿瘤细胞凋亡，下一步将对其具 体作用通路进行研究。

结论：miRNA- 205可直接或间接降低肾上 腺皮质癌细胞E2F1及VEGF-A的表达水平，增强 SW-13细胞对CDDP的敏感度，促进顺铂诱导的细 胞凋亡。