STK11（serine/threonine kinase 11，STK11） 基因最早是从Peutz-Jeghers 综合征（Peutz-Jeghers syndrome,PJS）患者中发现的，目前被认为是一 种抑癌基因，参与多个生物学过程和信号通路^[1]。 我们构建含目的基因STK11的EGFP融合载体转染 A549和H460细胞，并探讨其对肺癌细胞迁移能力 的影响。 1 材料与方法 1.1 材料

健康者胚肾细胞系293和人肺癌细胞株A549、 H460细胞、EGFP-N1、大肠埃希菌DH5α由徐州医学院肿瘤生物治疗实验室保存；人H460细胞购 买于南京凯基生物有限公司；引物合成及测序工 作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成； RPMI 1640培养液购自赛默飞世尔生物化学有限公 司；胎牛血清购于浙江天杭生物科技公司；限制 性内切酶、连接酶、RT-PCRKit Ver.2试剂盒、凝 胶回收试剂盒、质粒中量提取试剂盒均购自北京 TIANGEN公司；脂质体(lipofectamine 2000) 购于 Invitrogen 公司；STK11抗体、辣根过氧化物酶标 记的二抗购于abcam公司。 1.2 引物设计及STK11基因扩增

根据GenBank的LKB1基因序列（N M 000455.4），利用Primer predict和DNAclub软件 设计引物，引物由上海英俊生物技术有限公司合 成。引物上下游分别引入Hin dⅢ/KpnⅠ酶切位 点。上游引物：5’-ATAGCTAGCATGGAGGTGGT GGACCCG-3’，下游引物：5’-AGAGAATTCCTG CTGCTTGCAGGCC-3’。

按照Trizol试剂盒说明书，从293细胞中提取总 RNA，获得STK11全长。 1.3 重组质粒构建及鉴定

将末端加A后的目的基因STK11连接到PMD18- T载体上，得到pMD18- T- STK11重组 质粒。分别双酶切质粒pEGFP-N1和pMD18-TSTK11，获得pEGFP-STK11重组质粒。 用含阳性克隆的细菌抽提质粒 ，对质粒p EGF P - S TK11进行NheⅠ和EcoRⅠ双酶切， 37℃、2h，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。重组质粒送 交上海英俊生物技术有限公司进行基因测序，将 测序结果与质粒中插入序列的ORF对比，验证重 组质粒插入片段的正确性。 1.4 转染及实验分组

转染前一天，将处于对数生长期的细胞用 0.25%胰酶消化，分别将A549和H460细胞浓度调 整至为（2~5）×10⁷ cells/ml，接种至6孔板，待细 胞铺满板底80%~90%时，按照Lipofectamine 2000 转染试剂说明书进行转染。实验分pEGFP-STK11 重组质粒转染组和0.9%氯化钠溶液对照组。每组6 个复孔。 1.5 荧光显微镜观测和Western blot检测

在转染后12、24、48和72 h荧光显微镜下分 别观测两组细胞EGFP的表达情况。分别在转染后 24、48和72 h收集细胞，按照细胞蛋白提取试剂盒 要求提取蛋白，−80℃冰箱保存，Western blot检测 STK11蛋白表达。 1.6 划痕实验

在6孔板背面画平行直线做标记，每孔3条。 分别将两组细胞常规消化后，5×10⁵细胞/孔种植到 6孔板内过夜，待细胞基本融合达到80%时，弃去 培养液，用PBS清洗三遍后，用10 μl微量移液头 在6孔板内垂直于标记纵向划痕，PBS冲洗3次去 除细胞，加入无血清培养液继续培养。倒置显微 镜下，在3个不同的划痕部位拍照，48 h后在同样 的位置再拍照观察创伤愈合情况，应用Photoshop 软件计算划痕间距。实验重复3次，细胞迁移率= （划痕后即刻测量的划痕间距-划痕后48 h测量的 划痕间距）/划痕后即刻测量的划痕间距×100%。 1.7 统计学方法

应用SPSS19.0软件对实验数据进行统计分 析。统计描述、均数采用x±s表示，两组间均数比 较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 重组质粒鉴定

酶切鉴定结果显示在1 300 bp左右出现条带， 与STK11基因大小相同，见图 1。对pEGFP-STK11 插入片段进行测序，结果显示插入序列无突变， 与GenBank中STK11序列一致。

图1 pEGFP-STK11重组质粒双酶切鉴定结果 Figure 1 Double restriction enzyme digestion identif ication result of pEGFP-STK11 recombinant plasmid

A549细胞和H460细胞在转染后各时间点，荧 光显微镜下均可见pEGFP-STK11重组质粒组细胞 呈绿色，细胞形态完好，在转染后24 h EGFP表达 最强，见图 2；0.9%氯化钠溶液对照组细胞在转染 后各时间点，荧光显微镜下均未观察到绿色荧光。 在转染后各时间点，Western blot检测结果均 显示与目的蛋白分子量一致的目的条带，24 h时条 带颜色最深；而0.9%氯化钠溶液对照组未见目的 条带表达，见图 3。

A-D:Fluorescence microscopy detection of SKT11 gene expression after A549 cells transfected with pEGFP-STK11 for 12,24,48 and 72h, respectively;E-H:Fluorescence microscopy detection of SKT11 gene expression after H460 cells transfected with pEGFP-STK11 for 12,24, 48 and 72 h, respectively 图2 pEGFP-STK11质粒转染A549和H460细胞后绿色荧光表达情况( ×100) Figure 2 Fluorescent microscopy detection of A549 and H460 cells transfected with pEGFP-STK11 ( ×100)

Control:0.9% NaCl control group; 24 h:cells transfected with pEGFPSTK11 for 24 h;48 h:cells transfected with pEGFP-STK11 for 48 h;72 h: cells transfected with pEGFP-STK11 for 72 h 图3 Western blot检测STK11蛋白表达 Figure 3 STK11 expression detected by Western blot

与划痕后即刻测量相比，各组细胞在划痕后48 h，划痕距离均明显缩小，有融合的趋势，见图 4。两种细胞均显示pEGFP-STK1重组质粒转染组 划痕较0.9%氯化钠溶液对照组细胞愈合慢，转染 组细胞迁移率小于0.9%氯化钠溶液对照组，差异 有统计学意义（P<0.05），且H460细胞迁移率小 于A549细胞，见表 1。

A,B: wound closure of A549 cells in 0.9%NaCl control group after 0 and 48 h; C,D: wound closure of A549 cells in pEGFP-STK11 group after 0 and 48 h; E,F: wound closure of H460 cells in 0.9%NaCl control group after 0 and 48 h; G,H: wound closure of H460cells in pEGFP-STK11group after 0 and 48 h, respectively 图4 A549和H460细胞划痕实验检测细胞迁移情况 ( ×200) Figure 4 Wound closure of A549 and H460 cells detected by Wound-healing assay( ×200)

表 1(Table 1)

表 1 A549和H460细胞划痕实验结果（x±s, %, n=3） Table 1 Migration rates of A549 and H460 cells detected by Wound-healing assay（x±s, %, n=3）

表 1 A549和H460细胞划痕实验结果（x±s, %, n=3） Table 1 Migration rates of A549 and H460 cells detected by Wound-healing assay（x±s, %, n=3）

STK11基因位于人类染色体19p13.3区域上， DNA全长2155 bp，编码区含1302 bp，包括9个外 显子，其转录的mRNA约3.0 kb^[2] 。STK11编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶包含433个氨基酸残基， 功能结构域包含一个激酶区域和氨基端非催化区 域的核定位信号通路^[3]。STK11虽然最早在PJS综 合症中发现，但是有文献报道其在非小细胞肺癌 中也有散发性突变，突变率高达30% ^[4]。据文献报道，我们选择的H460和A549肺癌细胞株STK11基 因存在37密码子突变，无STK11蛋白表达^[5]。针对这两种细胞株进行STK11重组质粒转染，使之过表 达，更有利于研究STK11基因的生物学功能。对我 们构建的重组质粒双酶切琼脂电泳可显示1 302 bp 的目的基因条带，基因测序与GenBank中STK11序 列一致，提示STK11重组质粒成功构建。荧光显微 镜检测pEGFP-STK11重组质粒转染组细胞EGFP表 达，也提示STK11重组质粒成功构建。Western blot 结果显示转染后细胞有STK11蛋白条带出现，表明 重组质粒在细胞内正确表达。

STK11基因调节多项生物学过程包括细胞生 长、细胞周期、极化、转移和能量代谢^[6]。高益 军等^[7]报道STK11通过下游mTOR-HIF-1α信号通路 调控肿瘤转移相关基因LOX（lysyl oxidase）而介 导肺癌的转移，LOX上调可激活β-1-integrin信号 通路，增强细胞的侵袭能力。文献报道，在临床上观察到发生远处转移的肺癌患者中STK11突变 率增高^[8]。我们的细胞划痕实验提示，重组质粒转 染组细胞有细胞划痕愈合减慢的现象，初步证实 STK11有抑制肺癌迁移作用。我们下一步会采用 Transwell等方法进一步验证STK11基因的迁移抑制 作用，并通过检测Lox、Pdgf R和Vegfc等转移基因 来探讨其可能机制。