肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤 之一。据世界卫生组织(WHO)统计全球每年肺癌 新发病例超过120万，并呈逐年上升趋势。在中国 其死亡率也居恶性肿瘤死亡率之首^[1]。放疗是目前 临床最普遍和重要的肺癌治疗手段之一，但疗效 不理想，尤其是非小细胞肺癌对放疗不敏感，因此 肿瘤基因治疗联合放疗增敏成为国内外研究的热 点。EGR-1(early growth response-1 gene，EGR-1) 基因启动子序列中的放射敏感度CArG盒可在电 离辐射作用下启动并诱导下游基因大量表达，实 现基因射线双重杀伤效应^[2,3]。Bax是Bcl-2相关蛋 白，能抑制癌基因Bcl-2表达，促进细胞凋亡^[4]。本 实验室以Bax作为目的基因，已成功构建重组质粒 pGL3/EGR1-Bax，并在此基础上将该质粒转染肺 癌H460细胞，研究放射治疗后该质粒中Bax基因在 肺癌H460细胞中表达和诱导凋亡的作用。 1 材料与方法 1.1 主要材料

人肺癌H460细胞株（中国科学院上海细胞 所）；Bax兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc. USA）；RNA抽提试剂盒及RT-PCR试剂盒(日 本TOYOBO公司)；Lipofectamine™ 2000基因转染 试剂（美国Invitrogen公司）；Annexin V-PI双染试 剂盒（北京碧云天公司） ；PCR System 7500 美 国应用生物系统公司（Applied Biosy Stems）；酶 标仪（美国Thermo Varioskan Flash公司）；直线 加速器（美国Varian Medical Systems,Inc公司）； Quantity One凝胶分析系统（美国伯乐公司）。 1.2 重组质粒pGL3/EGR1-Bax的构建与鉴定 1.2.1 pTA2/EGR1、pTA2/Bax载体的构建与鉴定

分别设计扩增EGR1、Bax基因的引物,以小鼠 脑组织基因组DNA为模板,PCR法分别扩增(反应 条件：95℃ 1 min、95℃ 30 s、62℃ 1 min、72℃ 5 min,35个循环)EGR1、Bax基因的全长编码序列, 分别克隆入载体pTA2中,采用EcoRⅠ酶切与测序 进行鉴定，所构建的重组载体分别命名为pTA2/ EGR1、pTA2/Bax。 1.2.2 pGL3/EGR1-Bax质粒的构建与鉴定

再次设 计扩增EGR1、Bax基因，并含酶切位点及保护碱基 的引物，以pTA2/EGR1、pTA2/Bax为模板分别扩增 EGR1、Bax基因，分别采用KpnⅠ、NheⅠ，Hind Ⅲ、 XbaⅠ酶切位点将EGR1、Bax基因亚克隆至pGL3-Basic载体中，采用切酶与测序进行鉴定，所构建的 重组质粒命名为pGL3/EGR1-Bax。具体方法见参考 文献^[5]。 1.3 EGR1、Bax基因向H460细胞株的转染

复苏、培养及传代所购买的H 460细胞株，待细胞生长至60 %~ 80 %融合状态时，以 Lipofectamine^{™ 2000介导纯化的pGL3/EGR1-Bax质 粒转染细胞，具体按Lipofectamine™ 2000说明书 进行。采用Amp筛选获得足够数量阳性克隆的含 pGL3/EGR1-Bax质粒的H460细胞。以未转染及空 pGL3-Basic载体转染的细胞做对照。}

分组设计为H460空白对照组（不转染，不 照射），空载体组，载体组，单纯照射组，空载 体照射组，载体照射组，脂质体对照组。照射条 件：直线加速器（6 Mev电子线）照射或假照射各 组H460细胞10 Gy（剂量率：3 Gy/min），7 h后收 集细胞。 1.4 RT-PCR检测H460细胞Bax mRNA的表达

抽提H460细胞总RNA，进行RT-PCR分析，同 时设β-actin作为内参对照。Bax上游引物：5’-ACC CGGTGCCTCAGGATGCG-3’，下游引物：5’-GC TGCCACTCGGAAAAAGACCTC-3’；内参β-actin 上游引物：5’-CATGTTCGAGACCTTCAAC-3’， 下游引物：5’-CAGCTCGTAGCTCTTCTC-3’。 PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30s， 72℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物于 1.2%琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶图像扫描系统进 行密度扫描，计算Bax与β-actin的灰度比。 1.5 Western blot检测Bax蛋白的含量

提取每实验组H460的总蛋白，蛋白含量测定 按BCA法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。以每孔50 μg上样，10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)凝胶电泳分离，通过电转移法将蛋白 质从SDS-PAGE 凝胶转移至PVDF膜上。PVDF膜 在含5%脱脂奶粉的TTBS中室温封闭2 h，加入鼠抗 人Bax一抗（1∶500倍稀释）4℃摇床过夜，转至室 温放置约30 min，TTBS充分漂洗(10 min×3次)；加 入山羊抗小鼠二抗（稀释浓度为1∶1 000）室温反 应2 h，TTBS充分漂洗 (10 min×3次)。化学荧光法 （ECL）显色，以β-actin蛋白为内参照，曝光获取 图像。采用Quanity one 软件分析灰度值，比较各组 蛋白相对含量。 1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

将纯化的H460细胞直接收集到10 ml的离心管 中，每样本调整细胞浓度为5×10⁵ /ml，800 r/min离 心5 min，弃上清液，加入预冷1×结合缓冲液100μl 重悬细胞，再加入标记有异硫氰酸荧光素的磷脂 结合蛋白（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）各 5 μl于细胞悬液中，4℃下避光染色10 min，补加 490 μl结合缓冲液混悬细胞后行流式细胞仪分析。 结果判断：细胞的凋亡率为早期及晚期细胞凋亡 数/细胞总数×100%。 1.7 统计学方法

采用SPSS12.0软件包进行统计分析，数据采 用（x±s）表示，样本均数比较采用q检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 重组质粒的构建及鉴定

重组 pTA2/EGR1、pTA2/Bax质粒DNA分别 经EcoRⅠ酶切，0.7%琼脂糖凝胶电泳分别显示 2 957 bp 的pTA2骨架片段，含EGR1的907 bp与含 Bax的701 bp的目的片段。测序证实，所克隆到的 EGR1、Bax基因序列与GenBank发布的EGR1、Bax基因序列完全一致。重组pGL3/EGR1-Bax载 体经KpnⅠ、NheⅠ酶切,切下约3 794 bp与883 bp 的EGR1 片段；经Hind Ⅲ、XbaⅠ酶切，切下约4 000 bp 与677 bp 的Bax片段。测序证实,重组pGL3/ EGR1-Bax质粒构建成功，见图 1。

M:DNA marker；1:Hind Ⅲ, XbaⅠenzyme digestion PGL3-basic/ BAX-EGR1；2:PGL3-basic/BAX-EGR1;3:KpnⅠ,NheⅠenzyme digestion PGL3-basic/BAX-EGR1 图1 重组pGL3/EGR1-Bax载体的酶切分析 Figure 1 The restriction analysis of pGL3/EGR1-Bax

pGL3/EGR1-Bax 重组质粒转染H460细胞后， 分组予以直线加速器10 Gy照射或假照射。7 h后收 集细胞行RT-PCR法检测各组Bax基因转录水平； 裂解细胞，提取蛋白，用Western blot法检测Bax蛋 白表达水平。电泳结果见图 2，蛋白印迹见图 3。用Quantity One凝胶分析系统行半定量分析结果见 表 1、2，各载体组及载体照射组Bax基因转录及蛋 白表达水平与未转染组、空载体组、单纯照射组 比显著升高，P值均<0.05。且以转染载体并照射组 升高最为明显（P<0.01）。本实验表明辐射能诱导 pGL3/EGR1-Bax重组质粒中Bax基因在肺癌H460 细胞表达明显增强。

1: marker（ DL2000）;2: control group;3:empty vector group;4:empty vector irradiated group;5: irradiation group;6:vector group;7: carrier irradiated group;8:liposome control group 图2 各组H460细胞Bax mRNA的表达 Figure 2 Bax mRNA expression in H460 cells in each group

1: control group；2:empty vector group ；3: empty vector irradiated group；4: irradiation group；5: vector group；6: carrier irradiated group 图3 各组H460细胞Bax基因编码蛋白的表达 Figure 3 Bax protein expression in H460 cells in each group

表 1(Table 1)

表 1 各组H460细胞Bax mRNA的表达结果 (x±s，n=3) Table 1 Bax mRNA levels in H460 cells in each group (x±s，n=3) Notes：a: vs. Control group, P < 0.01；b: vs. Vector group, P < 0.05

表 1 各组H460细胞Bax mRNA的表达结果 (x±s，n=3) Table 1 Bax mRNA levels in H460 cells in each group (x±s，n=3)

表 2(Table 2)

表 2 各组H460细胞Bax 蛋白的表达结果 (x±s，n=3) Table 2 Bax protein Levels in H460 cells in each group (x±s，n=3) Notes：a: vs. Control group, P < 0.01；b: vs. Vector group, P < 0.05

表 2 各组H460细胞Bax 蛋白的表达结果 (x±s，n=3) Table 2 Bax protein Levels in H460 cells in each group (x±s，n=3)

Annexin V-PI双染，流式细胞仪检测显示， 见图 4,H460细胞凋亡率照射组（空载体照射组、 单纯照射组、载体照射组）较非照射组（即对照 组、空载体组、载体组）显著升高，P值均小于 0.01。载体加照射组与空载体加照射组细胞凋亡率 分别为(19.17±1.10) %与(13.31±1.11) %，两者相比 差异有统计学意义(P=0.00)。提示放疗能促进肺癌 H460细胞的凋亡，基因结合放疗能加速肺癌H460 细胞凋亡，见表 3。

A: control group；B: irradiation group；C: empty vector irradiated group；D: vector group；E: carrier irradiated group；F: empty vector group 图4 H460细胞凋亡率的Annexin V-FITC/PI流式细胞图 Figure 4 Annexin V-FITC/PI flow cytometry of apoptosis rate of H460 cells

表 3(Table 3)

表 3 各组H460细胞凋亡率 (x±s，n=3) Table 3 Apoptosis rate of H460 cells in each group (x±s，n=3) Notes：a: vs. Non-irradiated group，P < 0.01；b: vs.Empty vector irradiated group，P < 0.01

表 3 各组H460细胞凋亡率 (x±s，n=3) Table 3 Apoptosis rate of H460 cells in each group (x±s，n=3)

以手术、化疗、放疗为主的综合治疗是肺癌 的主要治疗方法，但疗效尚不理想，肺癌患者5年 生存率仍很低，美国约为15%，我国仅为10% ^[6]。

因此亟待寻找治疗肺癌的更为有效的手段。肿瘤 基因治疗联合放疗增敏是继手术、放疗及化疗之后兴起的一种新的治疗肺癌的方法，被认为是目 前治疗肺癌极有前景的治疗手段之一。肿瘤基因 治疗是将对肿瘤有直接或间接杀伤作用的基因经 载体转入体内，在肿瘤生长部位表达而发挥杀伤 肿瘤作用。Egr-1启动子的发现使放疗和基因治疗 得到了有效结合。国内外研究表明，Egr-1启动子 可受电离辐射等因素刺激而激活，进而诱导其下 游基因表达。Weichselbaum等于1992年首先提出基 因放射治疗的设想，该研究小组其后的实验结果 亦证实将具有辐射诱导特性的基因和肿瘤杀伤基 因一同转入肿瘤局部，在实施局部放疗的同时诱 导肿瘤杀伤基因表达，产生双重杀伤效果^[7]。

Bax是Bcl-2的相关蛋白，是Bcl-2家族中研究 最广泛的促凋亡蛋白，它作用于肿瘤的抑制物促 进细胞凋亡。Bax可与抗凋亡基因Bcl-2形成异源二 聚体，Bax与Bcl-2两者之间的比例决定了细胞的 命运，若Bax占多数，则Bcl-2被抑制，凋亡被诱 导，加速细胞死亡；反之则Bax受到抑制，细胞得 以生存^[8,9]。当细胞内Bax较多时，Bax自身亦可形 成同源二聚体占主导，从而促进细胞凋亡^[10]。由 于肿瘤细胞对放射的敏感度不同，不同程度上影 响了非小细胞肺癌放射治疗的效果。凋亡相关基 因Bcl-2在许多人类肿瘤中都存在着过表达，过高 的抗凋亡蛋白基因Bcl-2表达打破了正常的细胞凋 亡机制，使细胞对放疗和化疗表现出广泛的抵抗 性^[11]。因此我们构建pGL3/EGR1-Bax重组载体， 脂质体介导重组质粒转染肺癌细胞H460后进行电 离辐射的诱导。实验发现重组载体照射组Bax的 mRNA与蛋白表达量均较其他各组明显升高。提 示Egr-1启动子经辐射激活，刺激下游Bax基因在肿 瘤细胞表达显著增强，从而抑制了肿瘤细胞中高 表达的抗凋亡基因Bcl-2，增加了肺癌细胞的放射 敏感度，进一步促进Egr-1启动子的激活。

国内外学者将Egr - 1启动子连接P16 ^[12]、 INF^[13]、TNF-α^[13,14]、TRAIL ^[15]、endostatin ^[16]等不同的下游基因，联合放射治疗胰腺癌、食管癌等 不同的肿瘤都取得了明显的抑瘤效应。为了探讨 Bax基因联合放射治疗对非小细胞肺癌的作用， 本实验在构建辐射诱导表达载体pGL3/EGR1-Bax 的基础上，研究了体外转染联合辐射对肺癌H460 细胞凋亡的影响。结果表明，pGL3/EGR1-Bax重 组质粒转染H460细胞后联合照射组细胞凋亡率较 其他照射组明显升高，提示射线通过激活Egr-1启 动子诱导治疗基因Bax表达增强，从而加强了基因对肿瘤细胞的凋亡杀伤作用。本实验同时发现重 组载体组Bax的mRNA与蛋白表达量低于载体照射 组，高于其他各组；但重组载体组细胞凋亡率却 低于各单纯照射组，那么高表达Bax的载体组与单 纯照射组和空载体照射组相比凋亡率为什么更低 呢？可能由于辐射较高表达的Bax基因更为显著抑 制了肺癌细胞过高表达的抗凋亡基因Bcl-2，而致 单纯照射组和空载体照射组凋亡率较单纯重组载 体组更高。重组载体联合照射双重因素作用下导 致H460细胞凋亡显著增加。本研究为促凋亡基因 Bax联合放射治疗的临床应用提供了重要的理论和 实验依据。我们希望在以后的相关研究中继续探 索并逐步得到解决和论证。