乳腺癌在女性癌症死因中占首位^[1]，且因其新 发病例最多^[2]，发病年龄呈年轻化趋势，严重威胁 女性健康。但乳腺癌患病原因和恶性进程的精确分 子机制仍不十分清楚。 转化生长因子β诱导基因（transforming growth factor-β induced gene，TGFBI）也被称为Betaig-3， 是一种由TGF-β诱导的分泌蛋白，最初认为其与肿 瘤相关，是因为发现TGFBI能够使接种裸鼠体内肿 瘤细胞的致瘤能力减弱^[3]。最近研究发现，TGFBI 的FAS1结构域有抑制肿瘤作用，表现在抑制肿瘤 生长、血管发生及促凋亡作用^[4]。Zhao等^[4,5,6,7,8]发现很 多肿瘤细胞中TGFBI表达下降，并且体内、外实验 都发现外源性TGFBI能够抑制肿瘤细胞的恶性转 变。

本研究将外源性TGFBI转染到人乳腺癌细胞 (MDA-MB-231)中，得到稳定性表达TGFBI的细胞 株，观察TGFBI对乳腺癌细胞的生长和侵袭是否具 有抑制作用。 1 材料与方法 1.1 TGFBI转染及鉴定

人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)来源于美国 模式培养物集库存，使用DMEM完全培养液(英杰 公司,美国)，10%胎牛血清( Gibco公司,美国)， 100 µg/ml 链霉素，100 u/ml青霉素。TGFBI转染 的主要过程为：制备4 µg载体pRc/CMV2-TGFBI或 pRc/CMV2-空载体与转染试剂Lipofectamine Plus (英杰公司,美国)混合后，加入已接种细胞的6孔 培养板培养3 h；然后换完全培养液继续培养72 h。按1∶10比例把已转染TGFBI或空载体的细胞 分到100 mm的培养板中，在400 mg/ml 的G418培 养液(Sigma公司，美国)中培养，挑选稳定性表达 TGFBI或空载体的抗性集落。

采用实时定量PCR检测TGFBI mRNA的表达。 TRIzol (Invitrogen公司，美国) 提取细胞总RNA； RT试剂盒（英杰公司，美国）将提取的总RNA反 转录成cDNA；实时定量 PCR仪7300 (AB公司，美 国)，用SYBR Green定量分析TGFBI mRNA。内参 基因GAPDH (目录号PPH00150E) ，靶基因TGFBI (目录号PPH01904B)。PCR循环参数：95℃ 15 min；95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s，40个循环。 实验结果以倍数的变化2^-∆∆Ct表示，ΔCt = Ct_TGFBI- Ct_GAPDH ΔΔCt = Ct_样品-Ct_对照。

细胞培养24 h提取蛋白，加10%的三氯乙酸后 离心，用丙酮洗涤沉淀物两次，室温干燥；加50 µl 上样缓冲液煮沸5 min，上样，Western blot法检 测细胞培养上清液中TGFBI蛋白的表达。免疫组 织化学方法鉴定TGFBI在细胞内分布情况。使用 染色试剂盒 (Vector Laboratories公司,美国)，先用 1.5%马血清封闭样品，加1:1 000的人抗TGFBI单 抗（Minneapolis公司,美国）37℃孵育2 h，PBS 洗3次后；加1:5 000的二抗，室温孵育30 min，加 VECTASTAIN Elite ABC室温反应30 min，最后加 DAB ( 3,3’ - 二氨基联苯胺)底物显色6 min，双蒸水 冲洗；酒精梯度脱水后，加封片剂封固样品。在 BX60 奥林巴斯显微镜下观察TGFBI蛋白在细胞内 的分布。 1.2 细胞增殖测定

细胞增殖测定试剂盒（英杰公司，美国）检 测细胞增殖，先用无血清的 DMEM培养液培养细 胞36h，然后换用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培 养液培养 0、12、16、20及24后用PBS冲洗，加 入100 µl染料结合液，37℃孵育1 h。使用酶标仪 （Bio-Tec公司，美国）测定荧光强度。细胞增殖 率用增加的荧光强度百分数表示，即增加的百分 比 = ( n 时的荧光强度 - 0时的荧光强度) /0时的荧 光强度。 1.3 软琼脂克隆形成测定

将1 000个细胞与1 ml 0.35%琼脂糖混合，接 种于底部铺有0.75%琼脂糖的培养皿中，每组4个 平行样本。在10倍显微镜下观察并计算集落数， 实验结果用相对集落数表示，即相对克隆形成数 = 外源性TGFBI表达细胞的克隆形成数 /母代细胞的 克隆形成数。 1.4 细胞周期分析

无血清培养液培养细胞36 h，使细胞周期同 步化于G₀/G₁期。换用含10%胎牛血清的培养液培 养，在0、4、8、12、16、20及24 h后，收集包括 培养液中悬浮的全部细胞，75%冰乙醇4℃固定过 夜，用PI标记细胞，流式细胞仪(BD公司,美国)分 析细胞周期。 1.5 Western blot检测

将细胞接种于100 mm的培养皿中，使细胞 同步化于G₀/G₁期，换用10%胎牛血清培养液刺激 细胞进入新的细胞周期，在血清刺激后的不同时 间点，用冷的PBS冲洗细胞。用细胞裂解液（50 mMTris-Hcl,pH8,150 mM Nacl,1%SDS，1mM PMSF)提取蛋白质，用蛋白浓度试剂盒（美国伯 乐公司）测蛋白浓度，取30 µg蛋白质加入到50 µl 的上样缓冲液中煮沸5 min，上样于10%~20%SDS 胶（伯乐公司，美国），在电压20V的条件下电泳 2~4 h，在半干燥条件下将蛋白样品转移到PVDF膜 上。洗膜，5%脱脂牛奶封闭，分别加入1∶1 000 的P21、P53或β-actin一抗，4℃过夜，洗膜三次； 1∶5 000的二抗孵育2 h，洗膜三次；ECL显色液 (Amersham Biosciences公司，美国)，全自动洗片 机（KODAK公司，美国）进行全自动显色、洗片 和烘干。 1.6 体内致瘤性检测

2月龄裸鼠饲养在特殊的无病原体的环境中， 小鼠可以自由进食，饮水，日光/黑暗为12 h/12 h。 每组皮下注射5×10⁶个肿瘤细胞于裸鼠背部。每周 称体重，观察肿瘤的发生情况，注射细胞16周后 处死裸鼠。 1.7 免疫组织化学染色

将裸鼠皮下取出的肿瘤组织用10%福尔马林固 定一周左右，送病理室进行脱水、石蜡包埋、切片 后，进行Ki67和MECA-32的免疫组织化学染色。 一抗分别是Ki67和MECA-32，浓度为1∶100。每个样品随机选择5个视野共100个细胞，计数细胞 核或胞质呈棕黄色的Ki67或MECA-32的阳性细胞 数，数据以相对阳性细胞百分比表示，即阳性细 胞减少率 =（ 实验组-对照组）/ 对照组。 1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0进行统计学分析，各组实验数 据均重复3次，以均数±标准差 (x±s) 表示。先作 方差齐性检验，再用t-test进行两个均数之间的比 较。P<0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 TGFBI稳定性表达细胞株的鉴定

将外源性pRc/CMV2-TGFBI载体转染到 MDAMB-231中，转染细胞株命名为T231，从中挑选 T23108、23109和T23113细胞株用于本研究。实 时定量PCR结果显示，T23108、23109和T23113细 胞株中TGFBI mRNA表达明显高于其母代MDAMB-231细胞，与永生化乳腺上皮细胞MCF-10F中 的表达一致，见图 1A。免疫组织化学结果显示， T23113的细胞质和细胞核中均有TGFBI蛋白的表 达，见图 1B。Western blot结果显示，T23113细胞 培养上清液中TGFBI蛋白也明显高于母代细胞， 见图 1C。以上结果表明，外源性TGFBI转染后得 到了稳定性高表达的乳腺癌细胞株，接近于永生 化乳腺上皮细胞MCF-10F中TGFBI的表达。

A: the fold change of TGFBI mRNA expression level of the stable transfected cells calculated by 2-∆∆Ct; B: TGFBI protein expression in MDA-MB-231 transfected with TGFBI detected by immunohistochemical staining (DAB); C: TGFBI protein expression in MDA-MB-231 transfected with TGFBI detected by Western blot 图1 外源性TGFBI稳定性转染的乳腺癌细胞株中mRNA和蛋白表达 Figure 1 Expression of mRNA and protein in breast cancer cells transfected with ectopic TGFBI

图 2的结果表明，母代MDA-MB-231细胞在 血清刺激后12 h和24 h的增殖率分别为5.02%和 64.44%，而外源性TGFBI表达的T23108、T23109 和T23113细胞在血清刺激后的12 h，细胞几乎没有 增殖，在血清刺激后24 h的平均增殖率为39.62%。 说明外源性TGFBI可以明显地抑制乳腺癌细胞因 血清生长因子刺激的增殖。

Cell proliferation was assessed by CyQUANT NF proliferation kit at indicated times after serum stimulation. Proliferation rate was expressed as increased percentages = ( fluorescence density at nh – fluorescence density at 0h)/Fluorescence density at 0 h 图2 稳定转染外源性TGFBI与母代乳腺癌细胞株MDAMB-231增殖率比较 Figure 2 Comparison of proliferation rates of parental ectopic MDA-MB-231 cells and cells transfected with ectopic TGFBI

与转染空质粒的V 2 3 1 0 1细胞相比，外源 性TGFBI表达的细胞T23113，形成了较少的克 隆（P<0.01），相对软琼脂克隆形成数减少了 90.89%，表明TGFBI显著地抑制了乳腺癌细胞的 锚着独立性生长能力，见图 3。

Data were expressed as relative colonies = (colonies in TGFBIexpression tumor cells) / (colonies in parental tumor cells), *: P< 0.01, compared with V23101 transfected with vector control 图3 转染外源性TGFBI与空质粒的乳腺癌细胞株锚定独立性生长能力比较 Figure 3 Comparison of anchorage independent growth of breast cancer cell lines transfected with ectopic TGFBI and MDA-MB-231 cells

细胞周期同步化后，外源性TGFBI表达和母 代乳腺癌细胞处在G₁期的比例分别是68.57%和 64.29%。血清刺激后的不同时间，与母代细胞相 比较，外源性TGFBI表达的细胞处于 G₁期的比例 明显增多（P<0.05），而处于S期细胞比例减少， 尤其是在血清刺激后16 h更为明显（P<0.05）。表 明外源性TGFBI使乳腺癌细胞阻滞于G₁期，延缓 细胞分裂的进程，结果与2.2对细胞增殖的影响结 果相一致。

Line graph and plot illustrated the distribution of cells in the G1 and S phases over a time period of 32h 图4 外源性TGFBI对乳腺癌细胞周期的影响 Figure 4 Effects of ectopic TGFBI on cell cycle of breast cancer cells

转染空载体的V23101细胞与母代乳腺癌细胞 一样，在血清刺激后12和24 h 时P21和P53表达没 有明显变化，而外源性TGFBI表达的T23113细胞在血清刺激12和24 h时，P21和P53表达明显增多， 见图 5。实验结果提示，TGFBI是通过上调P21和 P53表达延缓乳腺癌细胞进入S期的。

图5 外源性TGFBI对乳腺癌细胞P21和P53瞬时表达的影响 Figure 5 Effects of ectopic TGFBI on temporal expressions of breast cancer cells P21 and P53

在注射母代乳腺癌细胞后第4周，裸鼠开始出 现肿瘤包块，至第5周时，所有注射母代和空载 体的MDA-MB-231细胞的裸鼠都发现肿瘤，肿瘤 发生率100%；而注射外源性TGFBI表达T23108、 T23109和T23113细胞的裸鼠至第6周时才发现有 肿瘤包块。至注射后第12周时，TGFBI组的肿瘤 发生率为83.33%[(3+4+3)/ (4+4+4)]，见表 1。说明 外源性TGFBI表达使裸鼠肿瘤发生潜伏期延长了2 周，发生率也减少了16.7%。

表 1(Table 1)

表 1 转染TGFBI的乳腺癌细胞对裸鼠体内肿瘤发生率的影响 Table 1 Effects of breast cancer cells transfected with ectopic TGFBI on tumor occurrence rate of nude mice in vivo

表 1 转染TGFBI的乳腺癌细胞对裸鼠体内肿瘤发生率的影响 Table 1 Effects of breast cancer cells transfected with ectopic TGFBI on tumor occurrence rate of nude mice in vivo

Ki67是肿瘤组织中细胞增殖的标志蛋白，可 证明TGFBI对体内肿瘤细胞生长的影响。结果显 示，与对照组相比较，注射T23108、T23109和 T23113细胞后，肿瘤组织中Ki67表达位于细胞核 内，呈棕黄色，见图 6A，阳性细胞的百分比平均 减少了33.84%，见图 6B。说明外源性TGFBI可以 抑制肿瘤组织中细胞的增殖，这与TGFBI抑制乳 腺癌细胞体外生长的结果一致。

A: Immunohistochemical staining of Ki67 protein in nude mice subcutaneously injected with breast cancer cells transfected with TGFBI;B: data showed relative percentage of positive cells, *: P<0.01, compared with V23101 cells 图6 外源性TGFBI对裸鼠体内肿瘤组织中Ki67表达的影响 Figure 6 Effects of TGFBI on Ki67 expression in nude mice tumor tissue in vivo

TGFBI是TGF-β诱导分泌的一种细胞外分泌蛋 白（ECM），也被称为βig-H3。TGFBI参与多种 生理过程，包括细胞形态、黏附、转移、血管发 生及炎症^[9]。小鼠胚胎组织的研究发现^[10]，胚胎 发育各阶段的许多组织间质都可以检测到TGFBI 的高表达，提示TGFBI对正常组织的发育是不可 缺少的。本研究也发现在永生化的乳腺上皮细胞 MCF-10F中，TGFBI蛋白不仅存在于培养细胞的 上清液中，也存在于细胞质和细胞核中，并且证 实了外源性TGFBI可以在乳腺癌MDA-MB-231细 胞中稳定性表达。Zhao等^[4]发现在放射诱导的恶变 BEP2D细胞中TGFBI表达降低，过表达TGFBI后， 肿瘤细胞克隆形成率下降，同时裸鼠成瘤率也下 降，对130例人肺癌组织进行免疫组织化学分析发 现，有45个肺癌组织表现为TGFBI低表达。本研 究体外实验结果表明，外源性TGFBI可能抑制乳 腺癌细胞的增殖，并且显著地抑制了乳腺癌细胞 的锚着独立性生长能力；体内实验结果也发现， 外源性TGFBI可抑制乳腺癌细胞增殖，从而降低 乳腺癌发生率，这与以上研究结果相一致，提示 TGFBI对乳腺癌细胞的生长也存在抑制作用。但 是，TGFBI抑制肿瘤细胞生长的机制尚不明确。 Wen等^[11]研究发现，TGFBI可以抑制肺癌和乳腺癌 细胞的体内外增殖，并且发现这种抑制作用与减 少软琼脂克隆形成能力、激活MMP2/9酶的活性， 从而提高细胞外基质穿透能力有关。

本研究结果显示，外源TGFBI能够使乳腺癌细 胞阻滞于G₁期，从而减少进入S期的细胞，抑制肿 瘤细胞的增殖。有研究者发现^[12]，TGFBI缺陷小鼠 胚胎成纤维细胞更易发生染色体畸变，细胞增殖 活性增强，细胞复制过早进入S期，从而增加癌变 几率。这与本研究结论相符。TGFBI是否通过这 一途径调节细胞周期，还需要进一步研究。

细胞周期在G₁期停留是为了检查DNA完整 性，主要是P53发挥作用。正常状态下，P53蛋白 含量低，当细胞异常时，p53基因活化，作用于 p21、DNA修复基因及Bax基因。p21基因活化后通 过抑制CDK及参与DNA复制的蛋白质，阻止细胞 进入S期，从而控制细胞增殖。本研究发现外源性 TGFBI可以使乳腺癌细胞P53和P21的瞬时表达增 高，与细胞周期停滞在G₁期相一致，说明调控p53 和p21基因是TGFBI影响细胞周期的一个途径。但 精确的分子途径仍需进一步研究。

综上所述，TGFBI可以明显抑制乳腺癌细胞增 殖，作为乳腺癌治疗的肿瘤抑制基因，具有潜在 的应用价值。