现阶段用于microRNA(miRNA)的基因检测多 源于新鲜组织，由于新鲜组织的获得和长期无破 坏保存都不易，因此不能满足相关研究的需要。 本课题前期研究发现在新鲜膀胱尿路上皮细胞癌 (膀胱癌)组织中miR-20a明显高表达^{[ 1, 2 ]}。本研究期 望通过研究膀胱癌石蜡包埋组织中miR-20a的表 达，探索石蜡包埋组织中提取miRNA的可行性， 并回顾性分析miR-20a表达与膀胱癌术后复发之间 是否存在相关性。 1 资料与方法 1.1 资料

调取2010年50例膀胱癌的新鲜冷冻（-80℃） 保存样品，同时将这50例组织进行石腊包埋处 理，另取5例经输尿管镜取石患者的正常膀胱黏 膜石蜡组织作为对照，其中男3例、女2例，年龄 25~75岁。比较石蜡包埋与新鲜冷冻组织miRNA表 达的相关性。调取2001年2月~2005年2月间临床随 访资料完整的181例膀胱尿路上皮癌的石蜡包埋组 织，另取这5年间20例经输尿管镜取石患者的正常 膀胱黏膜石蜡包埋组织作为对照，其中男15例、 女5例，年龄25~75岁。患者术前均未行放疗、化 疗与免疫治疗，均行膀胱部分切除术或经尿道膀 胱肿瘤电切术、术后均行膀胱灌注吡柔比星或羟 基喜树碱治疗，无全身放化疗患者。181例膀胱尿 路上皮癌石蜡包埋组织中男120例、女61例，年龄 22~85岁、平均65.2岁。组织病理分级按照WHO （2004年）分级标准，其中高分化103例、低分化 78例，见表 1。

石蜡标本总RNA提取试剂盒购自美国ABI公 司；miR-20a和内参U6反转录引物，miR-20a和 U6的引物和荧光探针混合体系，2×PCR TaqMan^® Universal PCR，TaqMan^®MicroRNA反转录试剂盒 均购自ABI公司。 1.2 方法 1.2.1 基因表达的检测

每份石蜡包埋组织切取 20 μm厚度5片，二甲苯和乙醇脱蜡后，蛋白酶 50℃消化3 h，按试剂盒说明书提取总RNA。核 酸定量仪检测并调整RNA浓度。新鲜组织总RNA 的提取按常规方法进行^{[ 1 ]}。按microRNA反转录试 剂盒说明书，以提取的总RNA为模板，用miR- 20a和U6反转录引物（5×TaqMan^®Gene Expression Assay Mix）反转录合成miR-20a和U6第一链，反 应条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃延长5 min；然后按2×PCR TaqMan^®Universal PCR试剂 盒说明，以miR-20a和U6第一链为模板，用miR- 20a和U6荧光探针（10×TaqMan^®Gene Expression Assay Mix）为引物扩增；反应条件：95℃预变性 10 min，95℃变性15 s，60℃延长60 s，共计40个 循环。以上荧光PCR检测均在7900HT型荧光定量 PCR仪（ABI公司）操作完成，检测方法为相对定 量分析2-ΔΔCt法，每次实验每个样品至少设立3个重 复，重复3次实验。 1.2.2 随访

术后前两年每3月随访一次，第三年 开始每6月随访一次，随访内容包括尿常规、尿脱 落细胞、泌尿系B型超声、膀胱镜检查等。随访时 间截止2010年12月31日。 1.3 统计学方法

采用SPSS11.5软件对数据进行统计处理。 新鲜组织与石蜡包埋组织中miR-20a分析比较用 Wilcoxon秩和检验；不同年度间组织miR的表达用 Kruskal-Wailis H检验； miR-20a表达与临床病理特 征的分析采用χ²检验；分析复发率由Kaplan-Meier 法评估，用Cox回归进行多因素分析，Log rank法 检验单因素对复发率影响的差异，以P<0.05为差 异有统计学意义。 2 结果 2.1 miR-20a在膀胱肿瘤中的表达

新鲜组织和石蜡组织中miR-20a的表达都明显 升高，石蜡组织和新鲜组织之间的表达存在明显 相关性（r=0.792，P=0.000），见图 1；不同年度 间石蜡组织的miR-20a表达稳定，相对表达量中 位数均在1.4附近,差异无统计学意义（H=22.636, P=0.533），见图 2，可见miR-20a的2^-ΔΔCt值的中位 数均在1.4附近。为定量分析miR-20a表达量对临床 病理特征的影响，我们将miR-20a的2^-ΔΔCt值≥1.5 定为高表达，＜1.5为低表达；石蜡组织中miR-20a 表达与临床病理的相关分析,见表 1；将表 1用Cox 多因素回归分析，结果显示：肿瘤分期、肿瘤分 化、miR-20a高表达3个因素是术后复发的独立因 素，见表 2。

miR-20a was significantly associated between the FF and their corresponding FFPE tissues.(FF:freshly frozen,FFPE:formalin-fixed paraffi n-embedded) 图 1 miR-20a在石蜡组织和新鲜组织之间表达的相关性 分析 Figure 1 Correlation analysis of miR-20a expression between fresh frozen and FFPE tissue samples

图 2 miR-20a在不同年度石蜡组织之间表达的一致性分析 Figure 2 The consistency analysis of expression levels of miR-20a in different years in FFPE tissues

表 1(Table 1)

表 1 石腊包埋组织中miR-20a表达与临床病理的分析 Table 1 Clinicopathological parameters for patients with bladder transitional cell carcinoma and their associations with the levels of miR-20a (P-value was calculated by χ2 test)

表 1 石腊包埋组织中miR-20a表达与临床病理的分析 Table 1 Clinicopathological parameters for patients with bladder transitional cell carcinoma and their associations with the levels of miR-20a (P-value was calculated by χ2 test)

表 2(Table 2)

表 2 影响术后复发因素的Cox回归分析结果 Table 2 Multivariate Cox regression analysis of overall relapse factors

表 2 影响术后复发因素的Cox回归分析结果 Table 2 Multivariate Cox regression analysis of overall relapse factors

随访时间6~60月，平均随访35.7月，181例患 者中共有65例复发，复发率为35.91%。其中高表 达miR-20a的56例患者中有35例复发，复发率为 62.50%，平均复发时间为13.11月；Log rank法检 验miR-20a低表达和高表达之间差异有统计学意义 （P=0.000），见图 3。

图 3 miR-20a表达与复发的相关分析 Figure 3 The correlation analysis of miR-20a expression and relapse

miRNA是由DNA转录产生的非编码小RNA 序列，由约18~25个核苷酸组成，不翻译生成蛋 白质，通过碱基互补的方式结合到靶信使RNA (mRNA)的3′非翻译区，从而抑制其翻译,但不影 响其转录^{[ 3 ]}。通过转录后基因沉默效应调控多种 抑癌基因或癌基因的表达，起促癌和抑癌的双向 作用。微阵列研究证实，每个miRNA可以调控上 百个基因的表达，即一个miRNA能靶向作用于上 百个mRNA，而且多个miRNA也能作用于同一个 mRNA^{[ 4 ]}，传统上新鲜组织一直是miRNA检测来源 的“金标准”，但在研究实践中，新鲜组织大量获 取和无破坏的长期保存相对困难，且新鲜组织的 临床资料相对不完整。临床资料比较完整的病例 其病理材料大部分都是石蜡包埋组织，而且获取 和保存相对容易，因此研究人员开始探索在石蜡 组织中提取miRNA，国内外已有研究认为石蜡包 埋组织处理过程对miRNA自溶、交联、断裂的影 响较小^{[ 5, 6 ]}。本研究也认为石蜡包埋组织中miRNA 可被提取并通过荧光PCR法精确定量，miRNA在 新鲜组织与石蜡组织间具有良好的相关性，不同 年度间石蜡组织的miRNA表达也基本稳定，具有 可比性。本研究证实经石蜡包埋组织提取miRNA 是可行的，石蜡包埋处理及长期存放对组织中 miRNA的研究无明显影响。通过临床资料完整 的、数量丰富的石蜡包埋组织对miRNA进行研 究，将进一步揭示miRNA的生物学作用。

miRNA通过转录后基因沉默效应不仅决定靶 蛋白的转录与否，而且可以精细调节靶蛋白的产 量^{[ 7 ]}，同时靶蛋白也对miRNA具有调节作用^{[ 8 ]}，二 者相互作用、精细调节细胞的生命活动，以防止 如肿瘤等过度增殖性疾病的发生。miRNA在基因 组上的分布是成簇的，通过一个共同的启动子被 转录^{[ 9 ]}。miR-20a是mir-17-92基因簇的成员，研究 发现miR-20a在许多肿瘤组织中有明显变化^{[ 10 ]}。细 胞实验证实抑制miRNA-20后，细胞凋亡增加，推 测miRNA-20可能有促癌作用^{[ 11, 12 ]}。本研究发现： 相对正常组织，miR-20a在膀胱移行细胞癌中的表 达升高，这种升高与肿瘤的病理分期、临床分期 以及肿瘤大小和直径都密切相关，在Cox多因素 分析中，如miR-20a在肿瘤中表达升高超过正常值 1.5倍，则患者可能处于一种疾病进展的状态，即 容易复发。如表达不到1.5倍，患者可能处于一种 疾病静止的状态；因此miR-20a可能在膀胱癌中 有双向作用，其抑癌或是促癌效应取决于表达量 的多少。已有一项引入数理推论的研究^{[ 13 ]}显示： miRNA的活性调控可能与其各自表达量有重要关 系，各自有相应的阈浓度，各调节因子数量的失 衡很可能是调节失控的始动因素，并试图建立数 学预测模型，本研究也支持了这种可能性。

本研究认为一种miRNA对癌变细胞起抑制或 促进作用不但取决于表达的组织，也取决于其表 达量的多少。再次证明了miRNA对细胞生命活 动的调节是非常精细的。对miRNA的研究不但 要定性，而且需要精确的定量，才能进一步明确 miRNA的生物学功能。因此下一步的重点是研究 其可能的靶基因和靶蛋白，完整地阐明miR-20a的 调控机制。