新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌发病率及 死亡率高，因此被列为新疆特高发肿瘤之一^{[ 1, 2, 3, 4 ]}。 前期研究利用二维液相色谱和质谱技术，通过维 吾尔族妇女宫颈癌血浆蛋白质学研究，发现多种 可能与宫颈癌密切相关的血浆差异蛋白，通过生 物学信息学IPA^@和Meta Core^TM分析平台最终确 定了4种候选血浆生物标志蛋白(数据待发表)，分 别是抗凝血酶Ⅲ（AntithrombinⅢ，ATⅢ）、绒 毛蛋白1（Villin1，VIL1）、凝集素（Clusterin， CLU）和免疫球蛋白（immunoglobulin kappa locus，IGK@）。但是，针对此高通量筛选的结 果，必须对其表达含量动态变化与宫颈病变进程 的关系进行验证，才能正确评价这些差异血浆蛋 白指标作为宫颈癌早期预警指标的可能性和可行 性。故本研究拟利用酶联免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA），通过对上 述候选血浆蛋白指标的定量分析，探讨宫颈病变 进程与血浆蛋白含量动态变化的关系，确立早期 诊断的血浆蛋白指标。 1 资料与方法 1.1 标本来源

收集新疆医科大学附属肿瘤医院在2011年1月 至2012年1月期间经病理确诊的宫颈病变患者血 浆标本共82例，其中宫颈炎（cervicitis）22例； CINⅡ~Ⅲ（cervical intraepithelial neoplasia）患者 20例；按2009年FIGO临床分期标准，选择临床 分期为Ⅰ~ⅡA的早期宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）患者血浆标本20 例；ⅡB~Ⅳ期肿瘤晚期CSCC患者的血浆标本20 例。患者年龄分布为25~65岁，平均年龄为53±6.78 岁。患者无子宫切除或骨盆放射治疗史以及无呼 吸系统、心血管和代谢性疾病等其他严重疾病。 与患者签署知情同意书，采集治疗前（肿瘤手术 切除、放化疗等）清晨空腹血液2~3 ml、离心分离 血浆(358 g，10 min)、置于-80℃冰箱保存备用。 1.2 主要试剂与仪器

人ATⅢ、VIL1、CLU的双抗体夹心酶联免疫 吸附定量测定试剂盒购自中国武汉优尔生科技股 份有限公司。市场尚无IGK@蛋白的试剂盒和抗体 供应，因此无法检测。酶标仪（Model 680）为美 国Bio-Rad公司产品。 1.3 实验方法

按照酶联免疫试剂盒说明书流程操作，首先 稀释标准品，依次倍比稀释成8 000 ng/ml、4 000 ng/ml、2 000 ng/ml、1 000 ng/ml、500 ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml，标准品稀释液（0 ng/ml）直接 作为空白孔(不同蛋白的标准品稀释方法不同)。 之后将血浆标本按说明书建议稀释。设标准孔、 待测样品孔、空白孔，分别加入100 μl样品和标准 品，酶标板加上覆膜，37℃温育2 h。分别加入A、 B工作液，重复洗版。最后加底物溶液90 μl，覆 膜，37℃避光显色10~15 min。加终止溶液50 μl终 止反应。酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值。 1.4 统计学方法

运用SPSS17.0软件进行数据录入和统计分 析，血浆载脂蛋白水平实验数据采用单因素方差 分析；两变量之间关系采用相关性分析，P<0.05 为差异有统计学意义，r＜0.4为低度相关，≥ 0.4~0.7为中度相关，＞0.7为高度相关。 2 结果 2.1 宫颈病变进程与血浆ATⅢ、VIL1和CLU的表 达含量动态变化的关系

ATⅢ表达含量随着宫颈病变进程逐渐下降， 见图 1A、表 1，CINⅡ~Ⅲ组较宫颈炎组差异有统 计学意义（P<0.05），且与宫颈癌早期及晚期组 比较差异有统计学意义（P<0.01）；CLU和VIL1 表达含量随着宫颈病变进程逐渐增高，CLU的表 达含量在CINⅡ~Ⅲ组、宫颈癌早期组逐渐升高， 与宫颈炎组（对照组）相比，差异均有统计学意 义（P<0.05），见图 1C。VIL1的表达含量在CIN Ⅱ~Ⅲ组、宫颈癌早期组和宫颈癌晚期组也逐渐升 高（P<0.05），并且在宫颈癌早期组和宫颈癌晚 期组间差异有统计学意义（P<0.01），见图 1B。

图 1 不同宫颈病变组患者的ATⅢ、VIL1和CLU表达含量动态变化的箱式图分析 Figure 1 Boxplot analysis of the dynamic changes of plasma proteins ATⅢ，VIL1 and CLU expression in patients with different cervical lesions

表 1(Table 1)

表 1 宫颈病变进程与血浆ATⅢ、VIL1和CLU表达含量动态变化的关系（ELISA分析,±s） Table 1 The correlation of cervical lesion development with the dynamic changes of plasma proteins ATⅢ,VIL1 and CLU expression（ELISA,±s） Notes: *: P<0.05 vs. cervicitis; **:P<0.01 vs. cervicitis

表 1 宫颈病变进程与血浆ATⅢ、VIL1和CLU表达含量动态变化的关系（ELISA分析,±s） Table 1 The correlation of cervical lesion development with the dynamic changes of plasma proteins ATⅢ,VIL1 and CLU expression（ELISA,±s）

为了明确每一个差异具有统计学意义的蛋白 之间是否有关联性，对不同蛋白之间进行相关性 分析，发现这三种蛋白之间均无关联性，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 伴随着宫颈病变的候选血浆蛋白质含量变化的相关性分析 Table 2 Correlation analysis of the dynamic changes of different candidate plasma proteins content with the development of cervical lesions

表 2 伴随着宫颈病变的候选血浆蛋白质含量变化的相关性分析 Table 2 Correlation analysis of the dynamic changes of different candidate plasma proteins content with the development of cervical lesions

近年来，高通量蛋白质组学技术以前所未有的 速度进展，为人类肿瘤的早期预警和分子诊断提供 了新的机遇，尤其是为肿瘤标志物的发现提供了 巨大前景^{[ 5 ]}。本研究在前期蛋白质组学研究中，通 过宫颈癌特异性改变的候选血浆蛋白指标筛查， 以及生物信息学生物标志物筛查分析，确定3种候 选预警蛋白ATⅢ、VIL1和CLU，对其动态变化和 有效性进行了验证。

ATⅢ是一种α2-球蛋白，是凝血酶和其他丝氨 酸蛋白酶的生理性抑制剂，已成功用于弥散性血 管内凝血的治疗。本研究结果中ATⅢ表达含量随 着宫颈病变进程加重而减少（P<0.05）。认为在 肿瘤阶段可能出现复杂的凝血-抗凝-纤溶系统的改 变，总体的高凝和抗凝功能降低，纤溶功能低下与 继发纤溶亢进可交替出现，表现为复杂的血栓前 状态，这种状态有利于癌栓形成，易于癌细胞的 黏附、浸润和转移^{[ 6 ]}。并且ATⅢ是肝脏合成的主要 抗凝物之一，其在肿瘤患者中表达降低，多数学 者认为是消耗增加或肝脏合成不足所致^{[ 7 ]}。但是近 年来研究发现，抗凝血酶具有抗血管新生、抑制 细胞增殖等抗肿瘤作用^{[ 8 ]}。

CLU存在于多种体液中，比如精液、尿液、乳 液、脑脊液及血清，同时发现它参与了细胞膜的 稳定、促进生殖、脂类的运输、补体的调节等^{[ 9 ]} 许 多生理功能。研究表明CLU与细胞凋亡有着密切 的关系，是一种凋亡抑制因子^{[ 10 ]}。CLU在前列腺 癌、肾癌、膀胱癌等泌尿系统肿瘤和乳腺癌、胰腺 癌、淋巴瘤等表达上调^{[ 11 ]}。本研究发现CLU随着宫 颈病变进程的发展其表达含量逐渐增高，宫颈炎 组（对照）与CINⅡ~Ⅲ、宫颈癌早期组相比差异 有统计学意义（P<0.01），提示其表达增高可以 作为癌前病变的早期预警指示。

VIL1是一种能够使肌动蛋白成束聚集在微绒 毛组成结构上起核心作用的肌动蛋白连接蛋白之 一^{[ 12 ]}。研究发现，VIL1在胃肠道癌、胰腺癌、胆 囊癌和胆管癌呈高表达^{[ 13 ]}，其表达仅限于上皮性 肿瘤而不表达于肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤，具有严 格的组织特异性。VIL1在炎性疾病和肿瘤的发生 发展过程中，发生了质和量的改变^{[ 14 ]}。本研究发现 VIL1在宫颈炎患者血浆中低表达，宫颈癌晚期表 达含量最多，其表达水平随着宫颈病变的进程逐 渐升高，含量水平变化与宫颈病变恶性进程呈正 相关（P<0.01），提示VIL1蛋白高表达对肿瘤分 化程度及组织转移来源的鉴别有一定的价值。

ATⅢ、VIL1和CLU表达含量之间的动态变化 无关联性，可能由于他们在肿瘤进程中的功能不 同，在表达调控通路中无相关性。

综上所述，ATⅢ、VIL1和CLU的表达含量动 态变化与维吾尔族妇女宫颈癌发生发展进程密切 相关，可以成为宫颈癌早期诊断的血浆候选预警 蛋白标志物。