胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤， 近年来发病率呈上升趋势^[1]。 胆管癌恶性程度 高、发展迅速，临床上难于早期发现，另外由 于胆管癌所在解剖部位复杂使得手术切除率很 低；而且一般的放、化疗疗效不满意，胆管癌预 后非常差。至今仍缺乏有效的早期诊断手段和 分子生物学标记，其诊治水平一直未能取得突破 性进展^[2]。从肿瘤生物学的角度寻求更好、更准 确的预测转移和预后指标是目前的研究热点。本 研究通过免疫组织化学测定肝癌组织中鼠双微体 基因2（murine double minute 2，MDM2）和第 10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因 （gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）的表达，并探讨它们与临 床病理特征以及这两个指标之间的关系。 1 资料与方法 1.1 一般资料

收集2007年1月—2010年12月蚌埠医学院第一 附属医院外科住院并行手术治疗的胆管癌患者资 料，选择其中临床资料完整的胆管癌患者42例， 癌旁22例，均经病理检查确诊，术前均未行放化 疗。男33例，女9例；年龄32~76岁，中位年龄55 岁；按AJCC的TNM分期标准：Ⅰ期7例，Ⅱ期11 例，Ⅲ期24例。按WHO病理分级标准：高分化癌 10例，中分化癌25例，低分化癌7例；局部淋巴结 转移：有转移10例，无转移32例。22例癌旁组织 取自距肿瘤边缘约1.0 cm的组织。BDC组织样本经 10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。4 μm厚连续 切片，每个样本至少三张，分别用于HE染色和免 疫组织化学染色。 1.2 主要试剂和方法 鼠抗人PTEN单克隆抗体购自美国DAKO公 司，鼠抗人MDM2单克隆抗体购自Santa Cruz公 司，Elivision TM plus KIT-9903（A、B）检测试 剂购自福州迈新生物技术开发公司。采用免疫组 化Elivision法检测MDM2与PTEN蛋白表达，具体 步骤按试剂盒说明书进行操作^[2]。用已知的MDM2 和PTEN阳性切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液 PBS代替一抗作为阴性对照。 1.3 结果判定

参考Lotan等提出的标准判断结果^{[3, 4]}，由两名 病理专家独立评价。简述如下：细胞核及胞质出 现棕黄色颗粒为阳性（+），无棕黄色颗粒为阴性 （-）。同一切片中随机选择10个高倍野，每个高 倍野考察100个癌细胞，计算阳性细胞的百分数，如果阳性细胞百分比＜10%，则为（-），阳性细 胞百分比≥10%为（+）。 1.4 统计学方法

应用SPSS13.0 统计分析软件进行数据分析， 各组免疫组织化学计数资料间以χ²检验或Fisher精 确法进行检验，MDM2和PTEN之间的相关性采用 Spearman等级相关分析，均以P＜0.05认定为差异 有统计学意义。 2 结果 2.1 MDM2蛋白表达与临床病理特征的关系

MDM2蛋白的阳性信号为棕黄色颗粒状，主 要定位于细胞核，阳性染色细胞见图 1C和1D。在 42例胆管癌样本中，有16例MDM2表达为阳性， 阳性率为38.1%；在22例癌旁组织样本中，MDM2 呈阴性表达。MDM2表达在胆管癌和癌旁组织之 间差异有统计学意义（P＜0.05）。

图 1 胆管癌的HE染色以及MDM2和PTEN在胆管癌组织中的阳性表达 Figure 1 Hematoxylin and eosin (HE) staining and positive expressions of MDM2 and PTEN in BDC

MDM2表达与临床病理特征之间的关系见表 1。 结果显示MDM2表达与分化程度、淋巴结转移有 关（P＜0.05），但与患者的性别、年龄、肿瘤大 小和TNM分期无关（P＞0.05）。

表 1(Table 1)

表 1 MDM2和PTEN表达与胆管癌临床病理参数之间的关系 Table 1 Correlation between the expressions of MDM2 and PTEN and clinicopathological parameters in BDC

表 1 MDM2和PTEN表达与胆管癌临床病理参数之间的关系 Table 1 Correlation between the expressions of MDM2 and PTEN and clinicopathological parameters in BDC

PTEN蛋白的阳性信号为棕黄色颗粒状，主要 定位于细胞质，阳性染色细胞见图 1E和图F。在 42例胆管癌样本中，13例PTEN表达为阳性，阳性 率为30.95%；在22例癌旁组织样本中，16例PTEN 表达阳性，阳性率为72.73%。PTEN在胆管癌组 织中的表达明显低于癌旁组织（χ²＝10.168，P＜0.05）。

PTEN表达与临床病理特征之间的关系见表1。 结果显示PTEN表达在患者性别、年龄、肿瘤大小 和分化程度、TNM分期以及淋巴结转移等临床病 理参数上差异均无统计学意义（P＞0.05）。 2.3 MDM2与PTEN蛋白表达的相关性

在42例胆管癌样本中，MDM2与PTEN的表达 呈显著负相关（rs＝-0.313，P＜0.05），见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 胆管癌组织中MDM2与PTEN表达的相关性 Table 2 Relationship between the expressions of MDM2 and PTEN in BDC

表 2 胆管癌组织中MDM2与PTEN表达的相关性 Table 2 Relationship between the expressions of MDM2 and PTEN in BDC

癌基因和抑癌基因的表达失常或失衡所导致 的细胞信号转导紊乱、细胞无控增殖在肿瘤的发 生、发展和转归上具有关键性作用。如前所述， 大量研究表明，抑癌基因PTEN、癌基因MDM2在 多种肿瘤中均有异常表达，并且在调节肿瘤细胞 生长、分化、侵袭转移和肿瘤血管新生等各方面 均有重要作用^{[5, 6]}。本研究考察了MDM2和PTEN在 胆管癌和癌旁组织中的表达，发现MDM2和PTEN 的蛋白表达在胆管癌及癌旁组织中有显著差异， 且MDM2表达与部分反映预后不良的临床病理参 数有关。PTEN表达与临床病理参数无相关性。

PTEN基因位于10q23，是目前发现的第一个具有双特异性蛋白磷酸激酶活性的抑癌基因，可 通过对抗PI3K的功能，抑制PI3K/Akt通路，进而 阻断Akt及其下游激酶的活性，发挥调控细胞的生 长和凋亡的作用^[7]。目前已在乳腺癌、卵巢癌、前 列腺癌等多种肿瘤组织中发现PTEN基因及蛋白表 达异常^{[8, 9, 10]}。本研究结果显示，PTEN蛋白在胆管 癌组织中的表达明显低于癌旁组织（P＜0.05）， 与Chung等^[11]测定结果一致，提示PTEN功能失活 或编码蛋白的缺失可能会诱导胆管癌组织癌变， 其机制还有待进一步研究。本研究还显示PTEN 表达与肿瘤大小、组织分化和淋巴结转移等均无 明显相关性，Chung等^[11]研究表明PTEN表达在肿 瘤组织分化差、临床分期晚的胆管癌样本中显著 降低。这种差异可能是由于实验技术方法不同， 或人种不同，以及各级病例数分布不均等因素所 致。

MDM2为鼠双微体基因，是一种原癌基因，可 与P53形成反馈调节环路，参与调控细胞生长。目 前已经证实MDM2在多种恶性肿瘤中发生了基因 突变、扩增、过表达^{[12, 13, 14, 15]}，且其与恶性肿瘤的生物 学行为、不良预后相关。关于MDM2在胆管癌中的 表达国内尚无报道，通过本研究发现，MDM2蛋白 表达率在胆管癌组织中显著升高，其表达与分化 程度、淋巴结转移有关，与其他病理特征无关。这 一现象提示MDM2的基因扩增可能与胆管癌的恶 性程度及转移侵袭有关。Jarnagin等^[16]研究表明在 包括起源于肝内胆管癌、肝门胆管癌以及远端胆 管癌在内的胆道腺癌中，MDM2均呈过表达。他们的研究认为在胆管癌R0切除后，MDM2的过表 达与胆管癌远处复发的高风险率有关，且可独立 预测胆管癌患者的生存率。这些结果说明MDM2 有可能作为胆管癌预后不良的指标。然而，我们 只通过IHC方法测定了MDM2的蛋白表达，其异常 表达的分子机制有待于进一步研究。

目前认为，MDM2蛋白在细胞质合成后,在 核定位信号的引导下从细胞质进入细胞核，这一 过程需要PI3K/Akt信号转导途径的参与，PTEN 对该途径的负调控阻止了MDM2蛋白由胞质进 入胞核，从而加速该蛋白的降解^[17]，进而解除了 MDM2对P53的抑制作用。本研究发现BDC中二者 均为阳性2例，MDM2（﹣）PTEN（＋） 11 例， MDM2（＋）PTEN（﹣）14例，MDM2（﹣） PTEN（﹣）15例，MDM2和PTEN蛋白表达之间 呈负相关性，提示在胆管癌中，MDM2的过表达 与PTEN基因的失活具有密切关系。

综上所述，本研究发现MDM2在胆管癌组织 中的表达异常升高，而PTEN在胆管癌组织中的表 达异常降低，且MDM2的表达与预后不良有关。 MDM2有可能作为评价胆管癌预后的指标。