结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，随着生活 水平的提高和环境的恶化，发病率已呈逐年上升的趋势。尽管治疗方法有了很大的进步，但总体 死亡率仍然很高。肿瘤的侵袭和转移是患者死亡 的主要原因之一。资料显示临床上约有50%的大肠 癌患者虽然经过有效的治疗，但最终仍然死于肿 瘤的侵袭和转移^[1] 。癌胚抗原 (CEA)在结肠癌预后 判断、疗效观察以及复发和转移的监测中是最常 用的肿瘤标志物。本课题组前期研究发现miR-155 在结肠癌组织中表达增高，可能作为原癌基因参 与结肠癌的发生、发展，与结肠癌的侵袭、转移密切相关^[2]。但miR-155能否成为一个新的肿瘤标 志物以便于为临床提供更多的诊断价值，目前国 内外鲜有这方面的临床和实验报告，为此，本实验 通过分析miR-155与CEA的相关性，探讨miR-155 在结肠癌疗效观察预后判断以及复发和转移的监 测等方面的价值，为临床寻找一种新的、理想的结 肠癌肿瘤标志物提供理论基础和实验依据。 1 资料与方法 1.1 一般资料

选取2009年3月至2010年12月湖北文理学院 附属医院普外科手术切除的原发性结肠癌标本84 例，每例均有癌旁组织(取材部位距离肿瘤边缘至 少2 cm)。其中男性46例、女性38例，中位年龄为 59岁。所有入选病例均经病理确诊，术前均未行 放、化疗。切除的标本30 min内放入液氮罐保存， 长期保存转至-70℃冰箱。 1.2 试剂与仪器

Trizol RNA提取试剂和反转录(RT)试剂盒购 自美国Invitrogen公司，miR-155和U6 snRNA qRTPCR 检测试剂盒均购自上海吉玛制药技术有限公 司，PCR扩增仪采用罗氏LightCycler；血清CEA 检测采用雅培i2000化学发光仪及雅培原装试剂。 CEA升高是指CEA>5 ng/ml。 1.3 组织总RNA的抽取

结肠癌组织及癌旁组织总RNA的提取采用 Trizol试剂一步提取法，实验步骤严格按照试剂说 明书进行。紫外分光光度仪检测RNA溶液OD₂₆₀、 OD₂₈₀的吸光度值，计算RNA浓度和纯度。另外用 1%琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的完整性。 1.4 反转录反应

由于miRNAs长度仅有20个核苷酸左右，不能 用传统的qRT-PCR检测。本实验采用上海吉玛制药 技术有限公司提供的miR-155检测试剂盒（Hairpinit^TM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit），内含针 对miR-155特异的茎环结构反转录引物。1 μl上述 提取的总RNA以此茎环引物进行反转录反应。取 特异性茎环引物2 μl，提取的总RNA1 μl，10 mM dNTP混合物1 μl，加灭菌蒸馏水至12 μl，混匀后 在65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却，瞬时离心 后加入5×第一链合成缓冲液4 μl，0.1M DTT2μl和 RNaseOUTTM核酸酶抑制剂1 μl，混匀后在37℃ 水域中孵育2 min；在室温下加入M-MLV反转录 酶1 μl，轻轻吹打混匀。37℃孵育50 min，最后 70℃加热15 min以终止反应。反应结束后反转录产 物-20℃保存备用。U6snRNA作为内参，同样进行 上述反转录反应，反转录产物-20℃保存备用。 1.5 实时荧光定量PCR

采用上海吉玛制药技术有限公司提供的 miR-155检测试剂盒，内含TaqDNA聚合酶，PCR反应缓冲液和特异的miR-155上下游引物。上游 引物为5’-ACGCTCAGTTAATGCTAATCGTGATA -3’，下游引物为5’-ATTCCATGTTGTCCACTGTC TCTG-3’。片段长度84 bp。取2×PCR Buffer 10 μl， miR-155上下游引物（5 μM）0.36μl,cDNA 2 μl, 5 u/μlTaq聚合酶0.2 μl,反应体系为20 μl。反应条 件为：95℃ 3 min；95℃20 s，60℃ 50 s共40个循 环。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的 阈值时所经历的循环数即Ct值。U6 snRNA作为内 参，同样进行上述定量PCR反应，其上游引物为 5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’；下游引 物为5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。片段长 度70 bp。采用实时定量PCR中的相对定量法，以 N=2^－△△Ct表示肿瘤组织miR-155表达相对于配对的 癌旁组织的变化倍数，其中△△Ct=(Ct_miR155-Ct_U6)肿瘤－ (Ct_miR155-Ct_U6)癌旁。 1.6 随访

术后患者出院前检测一次血清CEA水平。随 访时间定为2年，期间每2月查一次血清CEA水 平，血清CEA水平降到最低值后转而升高（持续 半年以上）的时间，记为术后血清CEA水平再次 增高的时间。术后每6月一次肠镜、胸部X线、B 超或腹部CT检查，以确诊患者是否出现复发转 移。随访方式主要采取门诊复查、电话访问。随 访应不影响患者采取适当的治疗方式。 1.7 统计学方法

应用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析， 结果用 x±s表示，两组之间计量资料样本比较采 用独立样本t检验，率的比较采用卡方检验。双 变量计量资料相关性分析用Pearson相关检验。以 P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 miR-155在结肠癌组织中的表达

miR-155及U6实时定量PCR扩增产物的熔解曲 线显示为单峰，说明茎环RT-PCR能扩增相应的目 的基因，见图 1。定量PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶 电泳呈单一条带，进一步验证了反应的特异性。 结果显示，在84例结肠癌组织中，相对于癌旁组 织对照，65例miR-155表达上调，其中24例上调大 于4倍，11例上调大于8倍；miR-155在结肠癌中的 表达水平(N=2^－△△Ct)为4.03±2.95倍，明显高于对应 癌旁组织，见表 1。

图 1 miR-155及U6实时定量PCR扩增产物的的熔解曲线 Figure 1 Melting curves of miR-155 and U6 amplifi cation products detected by real-time quantifi cation PCR

表 1(Table 1)

表 1 miR-155、U6在结肠癌和癌旁组织的Ct值 Table 1 Ct values of miR-155 and U6 in colon cancer and normal adjacent tissues

表 1 miR-155、U6在结肠癌和癌旁组织的Ct值 Table 1 Ct values of miR-155 and U6 in colon cancer and normal adjacent tissues

选取癌组织miR-155的表达倍数大于1的65例 病例，绘制以术前血清CEA水平的对数值为横坐 标，癌组织miR-155的相对表达倍数对数值为纵坐 标的散点分布图，见图 2。经Pearson相关性分析， 癌组织miR-155的表达倍数与血清CEA水平呈正相 关(r=0.708,t=7.959，P<0.01)。

图 2 结肠癌组织中miR155表达与术前血清CEA分布散点图 Figure 2 Scatter diagram of miR-155 expression and preoperative serum CEA levels in colon cancer tissues

随访2年内，24例患者术后血清CEA水平出 现增高，选取术后血清CEA出现增高的这24例患 者，以术后血清CEA水平出现增高的时间为横坐 标，癌组织miR-155的表达倍数为纵坐标绘制散 点分布图，见图 3。经Pearson相关性分析，癌组 织miR-155的表达倍数与术后血清CEA水平出现增高的时间呈明显负相关(r=-0.819,t=5.4920和 P<0.01)。

图 3 结肠癌组织中miR155表达与术后血清CEA水平出现 增高的时间分布散点图 Figure 3 Scatter diagram of miR-155 expression in colon cancer tissues and the time of serum CEA levels increasing after operation

随访2年内，获知结论（是否复发转移）的病 例为68例，其中出现复发或转移（与病患死亡无 关）有19例，复发转移率为27.94%。其中肝转移 7例(10.29%) ，肺转移2例(2.94%) ，淋巴结转移5 例(7.35%)，吻合口复发2例(2.94%)，腹（盆）腔 转移3例(4.41%) 。复发转移组癌组织中miR-155 表达水平为6.06±3.73倍，未复发转移组癌组织中 miR-155表达水平为3.62±2.55倍，两组比较差异有 统计学意义（P=0.0144<0.05），见图 4。术后血 清CEA水平出现增高时间≤24月的24例患者中有11 例复发转移，阳性率为45.8%；术后血清CEA水平 出现增高的时间>24月的44例患者中有8例复发转 移，阳性率为18.2%；两者比较差异有统计学意义 （χ²=5.89,P<0.05），见表2。

图 4 miR-155在术后复发转移组和未复发转移组结肠癌组 织中的表达 Figure 4 miR-155 expressions in group with recurrence or metastasis and group without recurrence or metastasis in colon cancer tissue after operation

表 2(Table 2)

表 2 术后血清CEA水平再次增高的时间与术后肿瘤复发 或转移的关系 Table 2 Correlation between the time of serum CEA level increasing again after operation and tumor recurrence or metastasis

表 2 术后血清CEA水平再次增高的时间与术后肿瘤复发 或转移的关系 Table 2 Correlation between the time of serum CEA level increasing again after operation and tumor recurrence or metastasis

结肠癌的发生发展是癌基因激活和抑癌基因 失活共同作用的结果，其确切的发病机制尚未完 全清楚。近年发现，miRNAs与恶性肿瘤密切相 关，主要通过与目标miRNA分子的3’端非编码 区域特异结合来抑制转录后的翻译。约52%调控 miRNAs的编码基因位于肿瘤相关基因位点和染色 体区域^[3]。因此miRNAs可能成为诊断肿瘤的新的 分子标志和判断肿瘤治疗及预后的分子靶点^{[4, 5]}。miR-155是最早被证实有促癌作用的microRNA分 子之一，其在乳腺癌^[6]、肺癌^[7]、结肠癌^[8]、胰腺 癌^[9]和肝癌^[10]等多种肿瘤中表达上调。此外，高表 达的miR-155与肺癌和胰腺癌的预后有关 ^[11]。

本研究利用茎环qRT-PCR技术检测miR-155 在结肠癌组织中的表达水平。结果显示，在84例 结肠癌组织中，miR-155在结肠癌中的表达水平为 4.03±2.95倍，明显高于对应正常黏膜组织。说明 miR-155在结肠癌组织中的表达明显上调，提示 miR-155与结肠癌的发生、发展密切相关。国内 Wang等^[12]采用miRNA微阵列分析和Q-RT-PCR两 种方法检测结肠癌中的miRNA表达，也得出了相 同的结论。Bakirtzi等^[8]通过动物实验证实，沉默 miR-155不仅可以阻止肿瘤细胞团的形成，还可以 减慢肿瘤细胞的生长速度，进一步证实miR-155参 与了结肠癌的发生、发展过程。

本实验通过随访发现，结肠癌组织中miR155 表达与术后肿瘤的复发或转移密切相关，由此可 以认为miR-155表达水平越高，术后肿瘤复发或转 移的几率就越高，患者的预后就越差。研究提示 检测结肠癌组织中miR-155的表达对预测术后肿瘤 的复发或转移有重要价值。目前miR-155在肿瘤浸 润转移中的具体作用机制尚未完全阐明，国外学 者对此进行了诸多研究。Kong等^[13]研究证实肿瘤 转化生长因子通过miR-155作用于RhoA蛋白，参 与了乳腺癌细胞的转移。Gironella等^[14]研究认为， miR-155在胰腺癌异常高表达，可能是通过抑制 TP53INP1的mRNA功能，导致其表达下降，从而 促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞的凋亡。这些 作用机制是否同样存在于结肠癌中有待进一步实 验证明。miR-155的出现为结肠癌转移的预防和治 疗提供了新的研究方向。

血清CEA是目前应用最广泛的肿瘤标志物之 一，在结肠癌、直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、 乳腺癌、肝癌及其他恶性肿瘤有不同程度的阳性 率，以在结、直肠癌患者中升高最显著。术后 血清CEA动态检测对结直肠癌术后复发转移的 监测有重要意义^[15]。实验研究发现结肠癌组织中 miR-155表达与血清CEA呈明显正相关性，与术后 血清CEA出现增高的时间呈明显负相关，这提示 在结肠癌发生、发展过程中，癌组织中miR155表 达越高，其血清CEA水平就越高，术后血清CEA 再次增高的时间就越短；同时本实验还发现术后 血清CEA水平再次增高的时间越短，肿瘤越容易 出现复发或转移。联合检测结肠癌组织中miR155 表达与术前术后血清CEA水平可以为临床疗效观 察、预后判断提供更加准确的信息，尤其在预测术后肿瘤的复发转移中有重要的价值。