微小RNA（miRNA）是新发现的长度为19~24 个核苷酸的非编码小分子单链RNA，可通过调控 靶基因的表达，在细胞分化、细胞周期及凋亡过 程中发挥重要作用。近来，miRNA与肿瘤的相关 性备受关注。研究发现，miRNA兼有类似癌基因 及抑癌基因的作用，在肿瘤的发生发展中起重要 作用^[1]。对肿瘤及正常组织中miRNA的差异表达 谱研究，有助于筛选特定功能的miRNA。本研究 采用miRNA芯片技术筛选直肠癌组织与正常组织 差异表达的miRNA，并对部分差异miRNA进行验 证，报道如下。 1 资料与方法 1.1 标本采集

随机选取2008年1月—2010年1月间在河北医 科大学第一医院普外科行手术治疗的直肠癌患者 手术标本18例，病理诊断均为直肠腺癌，所有患 者术前均未接受放疗、化疗。取癌组织及上切缘 正常黏膜（术后病理证实无癌组织侵犯），所取 标本离体时间均小于10 min，将组织块剪至约1 cm³ 大小，DEPC-PBS冲洗后迅速置于液氮中，后转至-80℃保存。 1.2 试剂

DEPC，Trizol 试剂购于美国 Invitrogen公 司，RNeasy mini kit RNA 试剂盒购于Qiagen 公 司，miRNA array相关试剂为美国LC science公 司产品。 Prime Script TM RT reagent Kit反转 录试剂盒和荧光定量PCR检测试剂盒购自美国 Ambion 公司，Taqman 引物为life technology 公 司产品（RNU6B:001093；miR-187:000487； miR-224:000599）。 1.3 试验方法 1.3.1 总RNA抽提

每100 mg组织样品加入1 ml 的Trizol 试剂，匀浆器匀浆。所加样品体积不超过 Trizol 试剂体积的10% 。按RNeasy mini kit RNA试 剂盒说明书纯化总RNA。 1.3.2 总RNA质量检测

使用NanoDrop®ND- 1000测定RNA在260、280和230 nm的OD值，计算 浓度并评估纯度。进行变性琼脂糖凝胶电泳，以 检测RNA纯度及完整性。 1.3.3 Paraflo^TM microRNA微阵列芯片分析

Paraflo^TM microRNA微阵列芯片分析由美国LC Sciences公 司完成。用YM-100离心过滤器（Millipore）分 离10 μg总RNA获得小RNAs。小RNA的3' 端用T4 RNA连接酶标记荧光染料Cy3和Cy5。用μParaflo 微流体芯片检测，微阵列芯片上的每个探针至 少重复3次，miRNA探针序列信息来自于Sanger miRBase Release 17.0 版本数据库。每个微阵列 实验都含有 16组质控探针用于质量控制。选择组 织内源的5S rRNA 作为miRNA芯片的内源阳性对 照；同时设立阴性对照和空白对照。 1.3.4 芯片扫描及数据处理

利用激光扫描仪 （Gene Pix 4000B，Molecular Device）采集杂 交图像并使用Array-Pro图像分析软件（Media Cybernetics）进行图像数字化转换。数据分析首先 是减去背景值，然后使用LOWESS过滤进行信号 归一化，将数据进行统计学处理，筛选出差异表 达的miRNA（P<0.05）。 1.3.5 实时定量RT-PCR为核对芯片的准确性

选 取有代表性的差异表达的miRNA（hsa-miR-187* 和miR-224）进行实时定量RT-PCR，以U6作为内 参。将1 μg 总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模 板进行PCR 扩增，95℃ 变性10 min，95℃ 15 s； 60℃ 1 min；共40个循环。 2 结果 2.1 总RNA提取的完整性及浓度

miRNA表达谱芯片试验要求评价标准为：RNA纯度：A_260/280在1.8~2.1之间，RNA总量≥3 μg，总 RNA完整性：经琼脂糖凝胶电泳检测，RNA样品 电泳28S、18S rRNA 条带清晰且28S:18S rRNA 条 带亮度大于或接近2:1。结果显示，全部标本RNA 完整性及浓度符合实验要求。组织总RNA提取的 完整性及浓度，见表 1。琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 完整性结果，见图 1。

表 1(Table 1)

表 1 组织总RNA 提取的完整性及浓度 Table 1 Details of total RNA isolated from rectal tissues

表 1 组织总RNA 提取的完整性及浓度 Table 1 Details of total RNA isolated from rectal tissues

图 1 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性 Figure 1 Total RNA integrity detected by agarose gel electrophoresis

将抽提所得的直肠癌及正常黏膜总RNA分 别进行miRNA芯片分析，结果显示直肠癌组织 miRNA表达谱与正常直肠黏膜有明显差异。聚 类分析可以将直肠腺瘤组织与正常黏膜组织明确 区分开，见图 2。为了找出正常直肠黏膜与直肠 癌组织miRNA表达的差异，将芯片中的数据经归 一化后进行统计分析，直肠癌组织与正常直肠黏 膜杂交信号强度的比值（T/N）>2为上调，<0.5 为下调。共筛选出70个直肠癌相关的差异表达 miRNA，其中33个表达上调，37个表达下调。其 中T/N<0.5的有22个，T/N >4的有17个，见表 2。

图 2 直肠癌与正常黏膜组织miRNAs 差异表达分层聚类图 Figure 2 Hierarchical clustering map of differential expressions of miRNAs between rectal tumor and normal rectal mucosal tissues

表 2(Table 2)

表 2 直肠癌组织与正常直肠黏膜表达差异的miRNAs Table 2 Differential expressions of miRNAs in rectal tumor and rectal mucosal tissues

表 2 直肠癌组织与正常直肠黏膜表达差异的miRNAs Table 2 Differential expressions of miRNAs in rectal tumor and rectal mucosal tissues

根据ratio比值，我们分别选取hsa-miR-187*以 及hsa-miR-224进行实时定量RT-PCR，计算公式： 相对表达量=2^-△△CT，-△CT=CT_待测miRNA－CT_U6。结 果如图所示：miR-187*在直肠癌组织中的表达较 正常直肠黏膜明显降低，见图 3A，而miR-224在癌 组织中的表达明显增高（P均<0.001），见图 3B， 与miRNA芯片结果，见图 3C，具有一致性。

图 3 RT-PCR 和基因芯片检测miR-187* 和miR-224的表达 Figure 3 Comparision of miR-187* and miR-224 expressions detected by real-time quantitative RT-PCR and microarray analysis

直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，全国范围内其发病率高于结肠癌，直肠癌早期预后较好，而进展 期预后较差^[2]。研究发现，miRNA与肿瘤关系密切， 可通过抑制转录后水平的蛋白翻译调节多种生物学 信号通路，参与调控肿瘤的发生和发展过程^{[3, 4, 5]}。

由于肿瘤组织中存在特定的miRNA表达谱， 可能在肿瘤的诊断及治疗方面发挥潜在的作用。 为了得到直肠癌差异表达的miRNA，本实验选 择了3例进展期直肠腺癌患者（均伴有淋巴结转 移），采用 microRNA Arrays技术分析正常直肠粘 膜、直肠腺癌组织中差异表达的miRNAs。该芯片含有1719条成熟的miRNAs探针，与成熟miRNA 完全互补，能特异性地检测出成熟的miRNA并能 很好地区分高度同源的miRNA分子，该平台还具 有特异性高、敏感度高等特点。经研究发现，直 肠腺癌与正常直肠黏膜相比，多个miRNA存在差 异性表达。对比文献报道，发现部分miRNA表达 变化与既往报道相吻合，上调的包括miR-182、 miR-17、miR-106a、miR-18a、miR-31、miR-224 等。下调的miRNA包括为miR-1、miR-29c、 miR-101、miR-139-5p、miR-150等。同时我们还筛 选出一些新的可能与直肠癌发展有关的miRNAs。

为了进一步验证芯片的准确性，我们分别挑 选了miR-187*和miR-224进行荧光定量RT-PCR 检测，结果证实与正常组织相比，直肠癌中hsamiR- 224的表达上调，hsa-miR-187*表达下调。 miR-187*（miR-187-5p）是miR-187家族的一员， 已有研究证实，卵巢癌和乳腺癌中miR-187呈高表 达且乳腺癌中miR-187的高表达和患者的不良预后 有关^{[6, 7]}，而前列腺癌和胰腺癌细胞中miR-187低 表达^{[8, 9]}。目前关于miR-187*在肿瘤中的研究鲜有 报道，Liu等^[10]发现miR-187*在胃癌患者中表达水 平明显升高，Ho等^[11]研究证实，毛细胞型星形细 胞瘤标本中miR-187*的表达水平明显低于正常组 织。然而未见在直肠癌组织中的相关研究。本研 究证实，miR-187*在直肠癌组织中表达下调，可 能发挥类似抑癌基因的作用，但具体的作用机制 尚待后续实验研究。

本实验中得到的另外一种差异表达miRNA— miR-224，在直肠癌组织中表达明显上调。研究证实 miR-224在多种肿瘤组织和细胞中表达上调，如肝 癌^[12]、子宫颈癌、胶质瘤等，且miR-224的高表达和 宫颈癌及胶质瘤患者的预后不良有关^{[13, 14]}。然而有学者发现，在乳腺粘液癌患者及前列腺癌中miR-224 的表达下调^{[15, 16]}。许多芯片筛选研究结果发现，结 直肠癌组织中miR-224表达上调^[17]，与我们芯片筛 选结果一致，如Vega等^[18]发现miR-224在结直肠癌 三期患者肿瘤组织中表达上调，Olaru等^[19]发现炎 症性肠病相关CRC患者肿瘤组织中miR-224表达上 调，且可能通过靶向调节p21蛋白发挥作用。肝细 胞癌中研究发现miR-224可以通过降低凋亡抑制 因子-5(apoptosis inhibitor 5,API-5)而参与细胞凋 亡^[20]，同时参与肝癌细胞的侵袭和转移相关^[21]。 关于miR-224在直肠癌中的作用及具体机制及参与 调控的细胞通路尚需进一步研究。

总之，我们应用芯片技术筛选出直肠癌特异性 miRNA表达谱，同时选取的均为Dukes C期或D期直 肠癌样本，相对于混合不同病理分期的实验样本， 增加了鉴定异常表达 miRNAs 的敏感度。直肠癌发 生过程中存在特异性miRNA改变，但其靶基因及具 体作用机制尚待阐明。相信随着各方面研究的深入， miRNA将在直肠癌的早期诊治方面发挥重要作用。