肺癌是最常见的肺部原发性恶性肿瘤，其 死亡率已居全球癌症之首^[1]。其高发病率和死亡 率与肿瘤的发生、发展及浸润、转移有密切关 系。转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGFβ1）是一种具有多种功能的多肽类生长 因子，其信号转导通路的异常往往是癌症发生、 发展以及浸润和转移的重要因素，尤其在进展 期肿瘤可促进细胞增殖进而促进肿瘤的侵袭及 转移。SPARC（secreted protein acidic and rich in cysteine）是一种富含半胱氨酸酸性蛋白，在肿瘤 中具有抗黏附、抗增殖、抗肿瘤血管生成作用并 调节细胞外基质的组成，可以抑制细胞周期，尤 其是在内皮细胞和平滑肌细胞，而内皮细胞和造 血细胞的增殖亦受具有抑制血管生成的肿瘤调控 基因TGFβ1的作用^[2]。目前SPARC在肺癌中的作 用尚不明确，而且SPARC、TGFβ1在肺癌中表达 关系报道较少。因此，本研究运用原位杂交检测 SPARC mRNA和TGFβ1 mRNA在肺癌中的表达及 临床意义，进一步探讨其与肺癌侵袭转移的关系。 1 资料与方法 1.1 资料

收集河北北方学院附属第一医院2008年-2012 年肺癌71例，病理诊断结果经2名以上病理医师确 认。男性51例，女性20例，年龄45~73岁，中位年 龄59岁；按WHO（2000）肺癌分类标准，组织学 分级高分化6例，中分化41例，低分化至未分化24 例；按组织病理学分类，非小细胞肺癌67例（腺 癌50例、鳞状上皮细胞癌15例、类癌1例、肉瘤样 癌1例）、小细胞癌4例；临床分期Ⅰ~Ⅱ期41例、 Ⅲ~Ⅳ期30例；有淋巴结转移者41例、无转移者30 例。同时收集30例相应的癌旁正常肺组织（距肿 瘤切缘>5 cm）作为对照组。所有患者术前均未行 放疗、化疗。 1.2 治疗方法

人SPARC、TGFβ1原位杂交检测试剂盒、原 位杂交专用盖玻片以及DAB显色试剂均购自武汉 博士德公司。针对人SPARC靶基因的mRNA序列 特异性片段为：5’-GCCTGGATCTTCTTTCTCCTT TGCCTGGCC-3’，5’-CTTCGACTCTTCCTGCCA CTTCTTTGCCAC-3’,5’-TGAAGAAGATCCATGA GAATGAGAAGCGCC-3’；针对人TGFβ1靶基因的 mRNA序列为：5’-ACCTGCAAGACTATCGACAT GGAGCTGGTG-3’,5’-TGTACAACAGCACCCGC GACCGGGTGGCCG-3’,5’-GTACCAGAAATACA GCAACAATTCCTGGCG-3’。 1.3 染色方法

严格按照博士德公司试剂说明书进行。 SPARC、TGFβ1原位杂交法：石蜡切片常规脱蜡 水化，3%H2O2灭活内源性酶，3%柠檬酸稀释的胃 蛋白酶消化液37℃消化处理30 min，暴露mRNA 核酸片段，PBS洗涤3次，每次5 min，蒸馏水洗涤 1次；1%多聚甲醛室温固定10 min。杂交过程， 在每张切片上滴加20 μl预杂交液置于40℃恒温箱 内预杂交3 h后，20 μl含探针杂交液40℃恒温箱内 杂交24 h。杂交结束后，37℃水温的2×SSC洗涤 2次，每次5 min，0.5×SSC洗涤15 min，0.2×SSC 洗涤15 min。滴加封闭液37℃30 min；滴加生物 素化鼠抗地高辛37℃ 60 min，PBS洗涤4次，每次 5 min；滴加SABC 37℃ 20 min，PBS洗涤3次，每 次5 min；滴加生物素化过氧化物酶37℃ 20 min， PBS洗涤4次，每次5 min；DAB显色后蒸馏水冲 洗，苏木精对比染色，脱水，透明封片镜检。 1.4 结果判定

SPARC mRNA阳性主要表达于纤维母细胞， 在内皮细胞胞浆内、癌细胞内偶可见表达，呈棕 黄色弥漫或颗粒状。参照文献的判断标准^[3]，根 据着色强度及阳性细胞百分比进行评分：无色为0 分，淡黄色（弱阳性）为1分，棕黄色（中等染色 强度）为2分，棕褐色（强阳性）为3分；阳性细 胞<1%为0分，≥1%~25%为1分，≥25%~50%为2 分，≥50%~75%为3分，≥75%~100%为4分。反 应得分为百分率得分与染色强度得分的乘积。每 张切片高倍镜下随机选择 5个癌组织视野观察,求 其平均值为该样本的阳性系数。

TGFβ1 mRNA主要分布于细胞的胞质，呈棕 黄色弥漫或颗粒状。按染色强度打分: 无色为 0 分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分； 按阳性率打分: 阴性为0分，阳性细胞率＜10%为1 分，10%～50%为2分，＞50%为3分。染色强度与 阳性细胞率的乘积：2 分为( - ) ，3 分为( + )。 1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对结果进行统计学分 析，主要运用χ²检验，SPARC mRNA和TGFβ1 mRNA的相关性采用 Spearman等级相关性分析， P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 SPARC mRNA和TGFβ1 mRNA在正常肺组织及肺癌中的表达

SPARC mRNA信号主要表达于癌细胞周围 的间质纤维细胞胞质，少数也可表达于胞核， 在癌细胞中阳性表达较少，但偶可见到有阳性表 达，阳性信号为棕黄色弥漫或颗粒状，其在肺癌 组织中的阳性表达率为61.97%(44/71)，与癌旁正 常肺组织20%(6/30)相比，差异具有统计学意义 (P<0.05)，见图 1、图 2。TGFβ1 mRNA信号染色主要 位于胞质，阳性信号为颗粒型棕黄色，其在肺癌 的阳性表达率为59.15%(42/71)，在癌旁正常肺组 织的阳性表达率为26.67%(8/30)，差异有统计学意 义(P<0.05)，见图 3。

图 1SPARC mRNA信号在肺癌组织间质纤维细胞中阳性表达（原位杂交 ×400） Figure 1The positive expression of SPARC mRNA signal in lung tissue stromal fi broblasts( in situ hybrization ×400)

图 2SPARC mRNA信号在肺癌组织癌细胞中阳性表达（原位杂交 ×400） Figure 2The positive expression of SPARC mRNA signal in lung cancer tissue（in situ hybrization ×400）

图 3TGFβ1mRNA信号在肺癌组织中阳性表达（原位杂交 ×400） Figure 3The positive expression of TGFβ1 mRNA signal in lung tissue（ in situ hybrization ×400）

SPARC mRNA在肺癌组织中的表达与肺癌的 临床分期及淋巴结转移有关（P<0.05），在临床 分期中，其在Ⅰ~Ⅱ期中的表达高于Ⅲ~Ⅳ期的表 达（χ²=5.164，P=0.023），差异有统计学意义; 其在无淋巴结转移中的表达高于有淋巴结转移者 （χ²=7.165,P=0.007），差异具有统计学意义，但 其表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、分化程 度及临床分类无关（P均>0.05）。TGFβ1mRNA 在肺癌组织中的表达与肿瘤大小、临床分期及淋 巴结转移有关（P均<0.05），TGFβ1mRNA在肿 瘤体积≥3 cm³中的表达高于肿瘤体积<3 cm³中的 表达（χ²=5.248,P=0.022），差异具有统计学意 义；在Ⅲ~Ⅳ期中的表达高于其在Ⅰ~Ⅱ期中的表 达（χ²=12.570,P＜0.01），差异具有统计学意义； 在有淋巴结转移中的表达高于无淋巴结转移者 （χ²=5.382,P=0.020），差异具有统计学意义。与 肺癌患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、临床分 类无关（P均>0.05）。随着肺癌肿瘤体积增大、 临床分期的进展及淋巴结出现转移时TGFβ1蛋白 的表达逐渐增加，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 71例肺癌SPARC、TGFβ1与临床病理参数的关系 Table 1 Relationship of SPARC,TGFβ1 with clinicopathological parameters of 71 cases of lung cancer

表 1 71例肺癌SPARC、TGFβ1与临床病理参数的关系 Table 1Relationship of SPARC,TGFβ1 with clinicopathological parameters of 71 cases of lung cancer

SPARC mRNA和TGFβ1 mRNA共同表达阳 性者为20例（28.17%）,共同表达阴性者为5例 （7.04%），SPARC mRNA表达阳性、TGFβ1 mRNA表达阴性者24例（33.80%），SPARC mRNA表达阴性，TGFβ1 mRNA表达阳性者22例 （30.99%），经Spearman等级相关分析可知两者 mRNA表达呈负相关性（r=－0.356，P =0.002）。 3 讨论

SPARC是一种富含半胱氨酸的小分子糖蛋 白，最早是由Termine等人于1981年鉴定出的 一种主要的骨非胶原成分，定位于人类染色体 5q31.3-q32，包含10个外显子，全长25.9 kb，编 码由298~304个氨基酸组成的蛋白。SPARC分为3 个独立的模块结构：（1）氨基末端酸性钙离子结 合区域（Ⅰ区），具有稳定细胞外基质的作用； （2）与卵泡静止素同源的铜离子结合区域（Ⅱ 区），富含半胱氨酸，具有抑制内皮细胞周期、 抗细胞黏附、抑制内皮细胞增殖及血管生成； （3）细胞外钙离子结合区域（Ⅲ区），具有改变 细胞形态、抗细胞黏附作用^{[4, 5]}。SPARC在肿瘤发 生发展中的作用取决于其在不同微环境中所表现 的不同功能。在恶性黑色素瘤中SPARC高表达， 通过反义RNA沉默SPARC表达后，在体外实验中 可观察到黑色素瘤细胞附着和侵袭性降低^[6]。在 结直肠癌中，免疫组织化学分析显示292例结直肠 癌患者中，SPARC表达者5年存活率较高^[7]。在卵 巢癌中，SPARC 表达水平与卵巢癌细胞系的恶性 程度呈负相关，而且加入外源性的 SPARC 或使 SPARC 再表达，可使卵巢癌细胞系的增殖活性下 降并介导细胞凋亡^[8]。Suzuki等^[9]研究显示SPARC 在肺癌细胞中表达减少，在间质细胞中高表达。 在本实验中，SPARC mRNA在肺癌组织中的阳性 表达高于癌旁正常组织（P<0.05），在癌组织中 主要表达于间质纤维细胞中，在癌细胞中阳性表 达较少，与文献^[9]研究一致，且在淋巴结未出现转 移时，临床分期越早（Ⅰ~Ⅱ期），SPARC mRNA 表达越高，考虑SPARC主要表达在间质纤维细胞 中，有可能起到维持肿瘤微环境稳态的作用，进 而可能抑制肺癌的进展。

TGFβ1是一种由二硫键连接的多肽二聚体， 最早是由Arends等在1983年从人血小板中提取， 并已被证实在细胞的生长调节中起重要作用。据 文献^[10]报道TGFβ1对肿瘤的作用是多样的，在肿瘤 发生的早期通过下调c-myc的表达，从而阻止肿瘤 细胞从G1期进入S期，以及增进抑癌基因p53及Rb 的活性进而发挥抑制细胞增殖、启动细胞分化、 诱导凋亡的作用；但在肿瘤的进展期通过抑制T 淋巴细胞活性，协助肿瘤细胞逃避机体的免疫监 视；通过作用于内皮细胞和具有促进血管生成的 细胞因子而形成一个易于血管形成的环境；诱导 细胞外基质的产生而促进肿瘤的侵袭和转移^[11]。 乳腺癌早期，TGFβ1 的负性调控作用能够抑制肿 瘤细胞生长; 而在后期，TGFβ1的抑制作用逐渐消 失，癌基因的失活和表观遗传学改变，使TGFβ1 能够促进肿瘤的运动、侵袭以及迁移^[12]。有研究 显示血清TGFβ1水平可以作为结直肠癌的肿瘤标 志物，有助于对结直肠癌临床诊断、术后复发及 高危对象的监测^[13]。Muinelo-Romay等^[14]报道高风 险的子宫内膜癌确定TGFβ1作为开始侵袭时的关 键因子。吴新天等^[15]研究显示在非小细胞肺癌中 TGFβ1的表达与非小细胞肺癌患者的肿瘤分期和 有无淋巴结转移有关，提示TGFβ1过度表达可能 提示病变有进展或转移。何欣蓉等^[16]报道TGFβ1可 能与肺癌发生及进展有关，有可能作为判断人肺 癌细胞恶性程度的指标之一。在本实验中，TGFβ1 mRNA在肺癌中的阳性表达高于癌旁正常肺组织 （P<0.05），随着临床分期等级的增加，淋巴结 出现转移时TGFβ1 mRNA表达越高。提示TGFβ1 可促进肺癌的进展，可能参与肺癌的转移过程。

有研究^[17]发现，SPARC和TGFβ1之间可以相 互作用。在血管发生期间，SPARC通过与TGFβ1 的受体endoglin相互作用限制血管周细胞对TGFβ1 的感知能力，在SPARC缺陷的周细胞中增添 TGFβ1，发现血管周细胞募集会减少，而SPARC 直接与endoglin结合，可阻碍TGFβ1通路，从而 使周细胞募集增加，肿瘤血管可趋于正常化。在 肾小球系膜细胞中，添加外源性SPARC蛋白，可 使TGFβ1下游信号转导通路中SMAD2（受体激活 性）蛋白磷酸化增加2~3倍，增强JNK(应激蛋白 激酶)活化水平及c-jun总磷酸化水平^[18]。JNK通路 是丝裂原活化蛋白激酶 ( mitogen- activated protein kinase，MAPK）信号转导通路之一，其作用主要 是将信号从细胞表面转导至细胞核内部，从而使 细胞发挥相应的生物学效应。TGFβ1作用于人成 纤维细胞，可以在5 h内介导SPARC蛋白的产生。 有研究发现SPARC并不与TGFβ1或其受体结合， 而是与TGFβ1及TβR-Ⅱ复合体结合，并增加其下 游的转导信号,在小鼠心肌细胞体外实验中SPARC 可增加TGFβ1依赖的SMAD2磷酸化水平^[19]。有研 究显示SPARC功能可能与TGFβ1相似，在肿瘤形 成早期癌细胞内低表达，而在晚期呈高表达，在 肿瘤的不同时期扮演抑癌基因还是癌基因^[10]。在 本实验中，SPARC主要表达在间质纤维细胞中， 且临床分期越早（Ⅰ~Ⅱ期）、淋巴结无转移时， SPARC mRNA表达较高，推测其有可能在肺癌中 起到维持肿瘤微环境稳态的作用，进而可能抑制 肺癌的进展。另外，在临床中肿瘤行手术治疗的 主要是Ⅰ~Ⅱ期的患者，收集的标本早期肺癌的例 数多于晚期，从而可能导致结果主要反映SPARC 在早期肺癌中的作用。对于TGFβ1，结果提示其 在肺癌中的作用可能是促进肺癌的进展，参与 肺癌的转移过程。本实验数据提示肺癌组织中 SPARC与TGFβ1的表达呈负相关性，SPARC的高 表达可能抑制肺癌的进展，TGFβ1的高表达可促 进肺癌的进展。

综上所述，肺癌组织中SPARC的高表达可抑 制肺癌的进展，而TGFβ1的高表达可促进肺癌的 进展，并参与肺癌的转移过程。此二者与肺癌的 发生、发展及恶性程度密切相关，通过检测此二 者的表达有助于判定肺癌的病理学分级，也有助 于肺癌临床评估及指导治疗。