MicroRNAs（miRNA）是一种内源性的非 编码小分子RNA，可以在转录后水平调节蛋白 质的合成，广泛分布于生物细胞体内。大量研究 已经证实miRNA在恶性肿瘤细胞的发生、发展 中发挥重要作用，其中包括调控细胞的增殖、分 化、凋亡以及侵袭和转移^{[1, 2]}。研究报道miR-96 在乳腺癌及结肠癌等恶性肿瘤中表达上调^{[3, 4, 5]}。过 表达miR-96可以促进乳腺癌细胞的增殖^[5]。然而 miR-96对肺癌细胞侵袭迁移能力的影响尚未见报 道。本实验采用荧光定量PCR法检测miR-96在肺 癌组织中的表达情况,同时利用反义寡核苷酸技术 （antisense oligonucleotide,ASO）抑制miR-96在肺 癌细胞中的表达，分析miR-96对肺癌细胞侵袭和 迁移能力的影响，同时检查侵袭相关蛋白MMP2和 MMP9的表达变化。 1 资料和方法 1.1 资料 1.1.1 临床资料

收集2006年1月—2011年1月武汉市普仁医院 和武汉市同济医院胸外科的肺癌及相应癌旁组织 手术标本116例。所有标本均经病理学检查确诊， 其中男106例，女10例，年龄32～69岁，平均年龄 49.60±2.29。所有患者术前均未接受放化疗。 1.1.2 主要试剂

肺癌A549和H1299细胞由本实验室保存； TaqMan miRNA分析试剂盒(美国ABI公司)； DMEM高糖培养液(美国Gibco公司)、胎牛血清 （美国Hyclone公司）、脂质体LipfectamineTM 2000 (美国Invitrogen公司)；反义miR-96寡核苷酸 (miR-96 ASO)(大连宝生物公司)；总蛋白提取试剂 盒（北京普利莱公司）、兔抗人MMP2和MMP9 单克隆抗体（美国Santa cruz公司）、β-actin二抗 （北京中杉金桥公司； Transwell Chamber（美国 Chemicon公司），人工基底胶Matrigel（美国 BD 公司）。 1.2 方法 1.2.1 实时荧光定量PCR检测miR-96的表达

提取组织中总RNA。反转录为cDNA。采 用SYBR Green法定量检测，反应条件：95℃ 15 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45个循 环，最后72℃延伸7 min。在每个循环的最后增加 溶解曲线。阈值定义为基础荧光信号的10个标准 差，即时循环数为Ct，计算目的基因的mRNA量， 公式：2-^△△Ct（ΔΔCt=miR-96 Ct-U6Ct_实验组–miR-96 Ct-U6Ct_对照组) ，实验重复3次。 1.2.2 反义miR-96寡核苷酸序列设计

设计miR-96反义寡核苷酸序列，同时设计 一条随机阴性对照序列,如下所示：miR-96正义： 5'-AGUCACUAGUGGUUCCGUUUA-3'，反义： 5'-TAAACGGAACCACTAGTGACT-3'，随机序列正 义：5'-UCUUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反义： 5'-AAGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。 1.2.3 反义寡核苷酸转染

运用LipfectamineTM 2000转染试剂盒进行转 染，反义miR-96寡核苷酸终浓度分别为：50、 100、150、200和250 nmol/L。本实验组筛选出最 佳终干扰浓度为150 nmol/L。转染后培养时间分别 为24、48和72 h,初步筛出最佳作用时间为48 h。 上述操作重复3次。 1.2.4 转染miR-96 ASO后对miR-96表达的影响

实验分为三组：空白对照组（MOCK组）、 转染随机ASO组（NC组）和转染miR-96 ASO 组 （miR-96 ASO 组），提取各组总RNA，测定 浓度，反转录为cDNA(反应条件同1.2.1)，测 定cDNA浓度。 运用microRNA检测试剂盒检测 miR-96的表达（具体条件同1.2.1）。上述操作重 复3次。 1.2.5 Transwell侵袭和迁移实验

实验分组同1.2.4。Transwell小室的上下室之 间以孔径为8 μm的聚碳酸酯微膜孔分隔开，滤膜 上层铺盖Matrigel（迁移实验无需铺Matrigel）。 用无血清的DMEM重悬细胞，调整细胞浓度为1× 106 个/毫升。吸取500 μl含 10%血清的DMEM于外 室中作为趋化因子，加300 μl细胞悬液于内室中， 37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。取出Transwell小 室吸除培养液，擦净小室滤膜上层的Matrigel及未 穿过滤膜的细胞。染色20 min，冲洗，风干。实 验中每组每次同时做3个重复小室，显微镜观察计 数，取平均值。 1.2.6 划痕实验

实验分组同1.2.4。采用记号笔在6孔板背面均 匀划横线。在孔中加入约5×105个细胞，第二天利 用10 μl枪头依横线划痕。PBS洗细胞3次，去除划 下的细胞，加入培养液。置于37℃、5%CO2培养 箱培养。0、48 h取样，显微镜下拍照。每个样本 至少重复3次。 1.2.7 检测各组细胞中MMP2和MMP9蛋白表达

实验分组同1.2.4。收集各组细胞，提取总蛋 白，经10%SDS-PAGE电泳后转膜，置含5%脱脂 奶粉的TBST缓冲液中37 ℃封闭2 h，加一抗稀释 液 1∶400稀释。兔抗人MMP2和MMP9单克隆抗 体在4℃孵育过夜，1×TBST缓冲液3次（每次10 min），加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG （1∶5 000稀释），37℃孵育2 h，1×TBST缓冲液 3次（每次10 min），运用ECL化学发光法检测目 的蛋白条带。以β-actin作为内参。 1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS17.0统计软件包进行分 析。计量资料以均数±标准差（ x±s）表示，癌及 癌旁组织比较采用配对样本t检验，多组均数之间 比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检 验，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 肺癌组织miR-96的表达情况

运用实时荧光定量PCR检测116例肺癌患者 癌及癌旁组织中miR-96的表达情况，结果发现： 63.80%（74/116）的病例肺癌组织miR-96的表达 明显高于相应的正常癌旁组织，差异有统计学 意义（t=26.53，P<0.05），见图 1，另外36.2% （42/116）的病例肺癌组织miR-96的表达与癌旁组 织相比差异无统计学意义（P<0.05）。

图 1实时荧光定量PCR检测116例患者肺癌及相应癌旁组 织miR-96表达的盒须图 Figure 1Box-plot of miR-96 expression in 116 cases of lung cancer and adjacent normal tissues by fluorogenic quantitative PCR

荧光定量PCR方法检测结果发现：A549细胞 转染miR-96 ASO组miR-96的相对表达量较空白 对照组和转染随机ASO组显著降低（F=391.66， P＜0.05）；H1299细胞同样发现miR-96 ASO组 miR-96的相对表达量较空白对照组和转染随机ASO 组显著降低（F=488.42，P＜0.05），见图 2。

图 2转染miR-96 ASO(antisense oligonucleotide)后A549和H1299细胞miR-96的表达变化 Figure 2Expression of miR-96 in A549 and H1299 cells after transfected with miR-96 ASO

通过各组细胞穿过人工基质胶的细胞数量 的多少，来评估各组细胞的侵袭能力，每组取5 个高倍镜视野。结果显示：转染miR-96 ASO组 的A549细胞侵袭能力与空白对照组及转染随机 ASO组相比显著降低（F=671.28，P＜0.05），而 空白对照组与转染随机ASO组差异无统计学意义 （P>0.05）；H1299细胞实验结果与A549细胞一 致。结果显示：转染miR-96 ASO组的H1299细胞侵 袭能力较空白对照组、转染随机ASO组显著降低 （F=741.18，P＜0.05），而空白对照组与转染随机 ASO组差异无统计学意义（P>0.05），见图 3。

图 3转染miR-96 ASO对A549（A）和H1299（B）细胞侵袭能力的影响 Figure 3Effect of miR-96 ASO transfection on invasion ability of A549(A) and H1299(B) cells

通过各组细胞穿过人工基质胶的细胞数量的 多少，来评估各组细胞的侵袭能力，每组取5个 高倍镜视野。结果显示：转染miR-96 ASO组的 A549细胞侵袭能力与空白对照组及转染随机ASO 组相比明显降低（F=472.57，P＜0.05），而空 白对照组与转染随机ASO组差异无统计学意义 （P>0.05）；H1299细胞实验结果与A549细胞一 致。结果显示：转染miR-96 ASO组的H1299细胞侵 袭能力较空白对照组、转染随机ASO组相比明显降 低（F=289.34，P＜0.05），而空白对照组与转染 随机ASO组比较差异无统计学意义（P>0.05），见 图 4。

图 4转染miR-96 ASO对A549(A)和H1299(B)细胞迁移能力的影响 Figure 4Effect of miR-96 ASO transfection on A549(A) and H1299(B) cells

采用划痕实验检测A549和H1299肺癌细胞的 迁移能力，结果显示，划痕48 h后，miR-96 ASO 组细胞划痕的愈合率比空白对照组和转染随机 ASO组明显下降，差异具有统计学意义(A549 细胞组间F=743.24，P<0.05；H1299细胞组间 F=564.18，P<0.05) ，见图 5。

图 5转染miR-96 ASO对A549(A)和H1299细胞(B)的划痕愈合能力的影响 Figure 5Effect of miR-96 transfection on the wound healing ability of A549(A) and H1299(B) cells

miR-96 ASO转染A549和H1299细胞后， Western blot检查各组细胞中MMP2和MMP9蛋白表 达水平，结果发现miR-96 ASO组MMP2和MMP9 的相对表达水平明显低于空白对照组和转染随机 ASO组（P<0.05），见图 6。

图 6MMP2和MMP9蛋白在转染miR-96 ASO 的A549和H1299细胞中的表达情况 Figure 6MMP2 and MMP9 protein level in A549 and H1299 cell after transfection of miR-96 ASO

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，侵 袭转移是患者死亡和治疗效果不理想的主要原 因。肺癌的侵袭转移是一个多步骤、多阶段、多 途径、多个因素共同调控的复杂生物学过程^{[6, 7]}。 miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有 调控功能的非编码RNA，其大小约20~25nt，通过 与靶mRNA互补配对从而导致mRNA降解或抑制转 录后蛋白翻译最终诱导基因沉默。近年来研究发现 miRNAs与多种恶性肿瘤的发生及侵袭转移相关^{[8, 9]}。 因此miRNAs可能成为诊断肿瘤的新的分子标志和 判断肿瘤治疗及预后的分子靶点，有助于肿瘤的 早发现、早诊断和早治疗^[10]。

研究已经证实miR-96在多种恶性肿瘤中表 达失调^{[3, 4, 5]}，但miR-96在肺癌中的表达及作用目 前尚不清楚。本实验利用实时荧光定量PCR检测 临床肺癌标本及相对应的癌旁肺组织，结果发 现miR-96在肺癌组织中呈明显高表达，这表明 miR-96在肺癌发生发展中发挥重要作用。为了研 究miR-96对肺癌细胞侵袭迁移能力的影响，本实 验通过转染miR-96 ASO降低肺癌细胞中miR-96 的表达，同时利用Transwell方法检测降低miR-96 的表达后，观察肺癌细胞侵袭迁移能力的变化， 结果显示转染miR-96 ASO的肺癌细胞侵袭迁移 能力明显降低。此外我们进一步利用划痕实验观 察到抑制miR-96的表达后，肺癌细胞的划痕愈合 能力明显下调。这些结果都表明miR-96在肺癌细 胞的侵袭迁移过程中起着非常重要的作用，这与 Chen等^[11]研究发现降低miR-96的表达可以明显抑 制肝癌细胞的侵袭迁移能力结果基本一致，说明 miR-96在恶性肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用。

为了进一步分析降低miR-96表达后引起肺癌 细胞侵袭迁移能力下降的可能机制，我们发现， 抑制miR-96的表达可以明显降低侵袭相关蛋白 MMP2和MMP9蛋白的表达，但生物信息学提示 MMP2和MMP9均不是miR-96的靶基因，所以我们 推测miR-96可能通过调控直接靶基因进而调节下 游MMP2和MMP9的表达，最终对肿瘤细胞侵袭迁 移产生影响，其具体机制有待于进一步研究。

综上所述，miR-96在调控肺癌细胞的侵袭和迁移 方面发挥重要作用，很可能成为一个新的肺癌侵袭转 移调节基因，为肺癌临床基因治疗提供新的靶点。