研究发现受体酪氨酸激酶(receptor tyrosinekinases, RTKs)家族成员受体EphA2及其配体 ephrinA1在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌等 多种恶性肿瘤的发生发展中共同起着复杂而重要 的作用，与肿瘤的增殖、血管生成、转移及不良 预后密切相关，其复杂的机制至今还没有完全阐 明。肿瘤的血管新生通常以肿瘤内微血管密度 (microvessel density,MVD)来表示。有研究认为， MVD既可作为反映血管生成程度的指标也可作为 反映胶质瘤预后的一项独立指标^[1]。

截至目前，有关EphA2、ephrinA1和CD105- MVD在人脑星形细胞瘤中的联合研究、对预后 评估是否具有协同作用，国内外尚未见报道。本 研究通过免疫组织化学的方法，检测不同级别 人脑星形细胞瘤组织与正常人脑组织中EphA2、 ephrinA1、CD105的表达情况，并探讨三者与星形 细胞瘤发生、发展以及患者预后的相关性，从而 为脑星形细胞瘤的临床靶向治疗及预后评估提供 新的理论依据。 1 材料与方法 1.1 标本

收集河北医科大学第二医院神经外科2008年 12月—2011年12月经手术切除脑星形细胞瘤标本 55例，资料完整，所有病例均在手术显微镜下获 得全切除，并在术后接受超选择化疗和放疗。平 均年龄（45.02±16.13）岁；作为对照的15例正常 脑组织通过脑外伤后内减压术获得，平均年龄为 （47.60±14.32）岁。所有组织均行病理组织学检 查确诊，并按照WHO（2007年）中枢神经系统肿 瘤分类、分级标准进行临床病理分期。其中Ⅰ级2 例，Ⅱ级10例，Ⅲ级23例，Ⅳ级20例。为了方便 统计，将Ⅰ~Ⅱ级归为低级别组，Ⅲ~Ⅳ级归为高 级别组。患者的生存资料主要通过门诊随访、电 话随访以及发随访信的方法获取,预后资料不完全 者按照截尾数据处理。 1.2 主要试剂

EphA2、ephrinA1兔抗人多克隆抗体（浓缩 型，用时按1:100稀释），CD105兔抗人单克隆抗 体（即用型工作液）及免疫组织化学二抗试剂盒 均购于北京中杉生物技术有限公司。 1.3 免疫组织化学法

采用链霉素-生物素过氧化物酶(SP)染色法， 具体操作步骤按SP试剂盒说明进行。设立阳性对 照，以PBS代替一抗作阴性对照。 1.4 EphA2、ephrinA1表达结果判定

参考相关文献^[2]进行肿瘤细胞阳性判定。染色 程度评价根据阳性细胞的百分比和染色强度相加之 和分为0~3级，0级：0~1分为阴性(−)；1级：2~3分 为弱阳性(+)；2级：4~5分为中度阳性(++)；3级： 6~7分为强阳性(+++)；染色程度1~3级为阳性。 1.5 CD105表达结果判定及MVD计算

参照Weidner^[3]报道的方法进行测定，避开肿瘤 坏死或出血区域，在低倍镜（×100）下选择新生血 管最丰富的“热点”（“hot spot”）区，每例标本观察 1张切片，计数5个高倍镜视野（×400）下微血管数 值，计算平均值作为该例切片的MVD值。 1.6 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，不 同组间EphA2、ephrinAl表达水平的比较采用χ2检 验，CD105标记的微血管密度（MVD）组间比较 采用近似t检验，EphA2、MVD和ephrinAl之间相 关性分析采用Pearson相关，不同组间生存期比 较采用单因素生存分析Kaplan-Meier方法，并经 Log rank检验；多因素预后分析采用Cox模型。P ＜0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 EphA2、ephrinA1和CD105- MVD的表达及其 与脑星形细胞瘤临床病理特征的关系

EphA2 、ephrinA1、CD105蛋白阳性染色主 要定位于细胞质和细胞膜，呈棕黄色或棕褐色颗 粒，核不着色，见图 1。星形细胞瘤组织内微 血管内皮细胞尚存在少量EphA2的表达。它们的 表达与患者性别、年龄及胶质瘤位置无明显相 关性(P>0.05)，与星形细胞瘤病理分级明显相关 (P<0.05)，见表 1。其中EphA2在星形细胞瘤的阳 性表达率（51/55）明显高于正常脑组织，差异有统 计学意义(P<0.01)；且随着星形细胞瘤恶性程度增 加，表达逐渐增强，高级别星形细胞瘤组(Ⅲ~Ⅳ) 中EphA2 、CD105-MVD两者表达显著高于低级 别组(Ⅰ~Ⅱ级)，差异有统计学意义(P<0.01)，见 表 2、图 1。ephrinA1则具有相反的趋势，在正常 组织中呈阳性表达，在大多数星形细胞瘤中呈阴 性或弱阳性（+）表达且恶性程度越高，表达水平 越低，见表 2、图 2。CD105-MVD在脑星形细胞瘤 组表达均值(34.26±12.61)明显高于正常脑组织组 (2.75±1.28),差异有统计学意义（P<0.01）；且高 级别星形细胞瘤组CD105-MVD的表达值（38.46 ±10.14）明显高于低级别星形细胞瘤组（16.75± 2.99），差异有统计学意义（P<0.01），见表 2、 图 3。当EphA2阳性表达及ephrinA1阴性表达增强 时,星形细胞瘤组织的CD105-MVD值也逐渐增加, CD105-MVD在EphA2表达阳性的星形细胞瘤组织 中表达均值（35.72±11.97）明显高于EphA2表达 阴性的星形细胞瘤组（17.60±6.58），差异显著 （P<0.01）；但CD105-MVD在ephrinA1表达阳性 的星形细胞瘤组表达均值（25.80±8.93）却明显 低于ephrinA1表达阴性的星形细胞瘤组（39.19± 10.20），差异有统计学意义（P<0.05）。

表 1(Table 1)

表 1 星形胶质细胞瘤标本EphA2和ephrinAl免疫组织化学染色评分与临床病理学特征的关系 Table 1 Relastionship of EphA2 and ephrinA1 IHC scores and clinicopathologic parameters

表 1 星形胶质细胞瘤标本EphA2和ephrinAl免疫组织化学染色评分与临床病理学特征的关系 Table 1Relastionship of EphA2 and ephrinA1 IHC scores and clinicopathologic parameterss

表 2(Table 2)

表 2 EphA2、ephrinA1和CD105-MVD在正常脑组织及星形细胞瘤组织中的表达 Table 2Expressions of EphA2,ephrinA1 and CD105-MVD in astrocytomas and normal brain tissues by immunohistochemistry

表 1 EphA2、ephrinA1和CD105-MVD在正常脑组织及星形细胞瘤组织中的表达 Table 2Expressions of EphA2,ephrinA1 and CD105-MVD in astrocytomas and normal brain tissues by immunohistochemistry

图 1EphA2在正常脑组织及星形细胞瘤中的表达(SP ×400) Figure 1EphA2 expression in normal brain tissues and astrocytomas by immunohistochemistry(SP ×400)

图 2ephrinA1在正常脑组织及星形细胞瘤组织中的表达(SP ×400) Figure 2ephrinA1 expression in normal brain tissues and astrocytomas by immunohistochemistry(SP ×400)

EphA2 、ephrinA1、CD105蛋白阳性染色主 要定位于细胞质和细胞膜，呈棕黄色或棕褐色颗 粒，核不着色，见图 1~3。星形细胞瘤组织内微 血管内皮细胞尚存在少量EphA2的表达。它们的 表达与患者性别、年龄及胶质瘤位置无明显相 关性(P>0.05)，与星形细胞瘤病理分级明显相关 (P<0.05)，见表 1。其中EphA2在星形细胞瘤的阳 性表达率（51/55）明显高于正常脑组织，差异有统 计学意义(P<0.01)；且随着星形细胞瘤恶性程度增 加，表达逐渐增强，高级别星形细胞瘤组(Ⅲ~Ⅳ) 中EphA2 、CD105-MVD两者表达显著高于低级 别组(Ⅰ~Ⅱ级)，差异有统计学意义(P<0.01)，见 表 2、图 1。ephrinA1则具有相反的趋势，在正常 组织中呈阳性表达，在大多数星形细胞瘤中呈阴 性或弱阳性（+）表达且恶性程度越高，表达水平 越低，见表 2、图 2。CD105-MVD在脑星形细胞瘤 组表达均值(34.26±12.61)明显高于正常脑组织组 (2.75±1.28),差异有统计学意义（P<0.01）；且高 级别星形细胞瘤组CD105-MVD的表达值（38.46 ±10.14）明显高于低级别星形细胞瘤组（16.75± 2.99），差异有统计学意义（P<0.01），见表 2、 图 3。当EphA2阳性表达及ephrinA1阴性表达增强 时,星形细胞瘤组织的CD105-MVD值也逐渐增加, CD105-MVD在EphA2表达阳性的星形细胞瘤组织 中表达均值（35.72±11.97）明显高于EphA2表达 阴性的星形细胞瘤组（17.60±6.58），差异显著 （P<0.01）；但CD105-MVD在ephrinA1表达阳性 的星形细胞瘤组表达均值（25.80±8.93）却明显 低于ephrinA1表达阴性的星形细胞瘤组（39.19± 10.20），差异有统计学意义（P<0.05）。 2.2 EphA2、ephrinA1和CD105-MVD表达的相关性 EphA2表达与CD105-MVD呈显著正相关（r= 0.713,P<0.05），ephrinA1表达与CD105-MVD呈显 著负相关（r=−0.772,P<0.05），EphA2的表达与 ephrinA1的表达呈显著负相关（r=−0. 912,P<0.05）。

图 3CD105在正常脑组织及星形细胞瘤组织中的表达(SP ×400) Figure 3CD105 expression in normal brain tissues and astrocytomas by immunohistochemistry(SP ×400)

在55例星形细胞瘤标本中，EphA2、ephrinA1 均阳性25例，EphA2阳性、ephrinA1阴性26 例，EphA2阴性、ephrinA1阳性2例，EphA2、 ephrinA1均阴性2例。按照星形细胞瘤标本中 EphA2、ephrinA1的阴性阳性表达和CD105-MVD 的高低表达（以均值34.26为界，分为低表达组 L-CD105-MVD（≤34.26)和高表达组H-CD105- MVD（>34.26）分别进行Kaplan-Meier生存分 析，见图 4，并对星形细胞瘤患者随访资料进行 单因素Log rank检验，发现EphA2阳性ephrinA1 阴性CD105-MVD高表达的星形细胞瘤患者较三 者均阳性或三者均阴性或EphA2阴性ephrinA1 阳性、CD105-MVD低表达的患者生存期明显缩 短。表明EphA2、ephrinA1和CD105-MVD均是 影响星形细胞瘤预后的因素，且具有重要的预后 意义。多因素Cox风险模型分析也显示EphA2、 CD105-MVD和ephrinA1都是风险因子，EphA2 （1.981）和CD105-MVD(0.965)的回归参数均为 正值,说明其表达越高,生存期越短；ephrinA1的 回归参数为负值(−1.114)，说明其表达越高，生存 期越长。EphA2阳性表达、CD105-MVD值增高、 ephrinA1阴性表达均提示星形细胞瘤患者死亡的 风险增加，其中EphA2的相对危险度最高为5.861 （P=0.012），说明EphA2阳性表达的患者死亡的 风险为阴性表达患者的5.861倍，CD105-MVD的相 对危险度次之为2.625（P=0.021），ephrinA1的相 对危险度最小为0.328（P=0.028）。

图 4CD105在正常脑组织及星形细胞瘤组织中的表达(SP ×400) Figure 4CD105 expression in normal brain tissues and astrocytomas by immunohistochemistry(SP ×400)

脑胶质瘤(gliomas)是颅内最常见的原发性神经 上皮恶性肿瘤，占脑肿瘤的30%~60%，其中星形 细胞起源的胶质瘤最多见，由于胶质瘤细胞的侵 袭性生长，即便是采用手术、化疗、放疗等综合 治疗措施，患者的平均生存期也仅为12~15月。 3.1 EphA2- ephrinA1在星形细胞瘤中可能的作用

研究显示EphA2在脑胶质瘤、肾细胞癌等^{[4, 5, 6]} 多种恶性肿瘤中均高表达。而ephrinA1可高表达 于结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌及前列腺癌等^[6]多 种恶性肿瘤，但也有报道ephrinA1在大多数乳腺 癌细胞中呈低水平表达^[7]。本实验证实星形细胞 瘤中EphA2的表达与ephrinA1的表达呈显著负相 关，ephrinA1低表达时，EphA2则过表达；相反， ephrinA1高表达时，EphA2则呈低表达。实验中 发现星形细胞瘤组织内微血管内皮细胞也存在少 量EphA2的表达，说明EphA2可能参与脑星形细 胞瘤血管的生成。本研究证实CD105-MVD在脑 星形细胞瘤中表达明显高于正常脑组织，EphA2 表达与CD105-MVD呈显著正相关，ephrinA1表达 与CD105-MVD呈显著负相关，即随着EphA2阳性 表达强度增加及ephrinA1阴性表达强度增加,星形 细胞瘤组织的CD105-MVD也逐渐增加,这可能是 由于星形细胞瘤大量新生血管形成并促进了星形 细胞瘤细胞的侵袭性改变和失控性增殖。笔者认 为EphA2- ephrinA1不仅可能与星形细胞瘤细胞恶 性程度及侵袭性有关，而且还与血管生成有关， EphA2的过表达与ephrinA1的缺陷表达可能协同参 与星形细胞瘤血管生成。 3.2 EphA2- ephrinA1、CD105-MVD与星形细胞瘤患者预后可能的关系

通过随访发现EphA2、CD105-MVD阳性、 ephrinA1阴性的星形细胞瘤患者较三者均阳性或三 者均阴性或EphA2、CD105-MVD阴性ephrinA1阳 性的患者生存期明显缩短，说明EphA2、CD105- MVD高表达、ephrinA1低表达与高级别星形细胞 瘤和不良预后密切相关。这与COX模型多因素预 后分析结论“EphA2、CD105-MVD和 ephrinA1均 是重要的恶性脑星形细胞瘤预后相关风险因子， 均具有重要的预后意义”相一致。李侠等^[8]针对90 例星形胶质瘤的回顾性研究证实EphA2表达水平与 肿瘤病理分级和细胞增殖呈正相关，与细胞凋亡 呈负相关，强烈提示EphA2是重要的脑胶质瘤预后 相关因子。EphA2也可作为预测肾细胞癌、乳腺癌 等^{[9, 10]}患者生存率、复发及预后的一个重要因素。 Wang等^[4]对32例GBM进行长期随访，发现EphA2 的高表达对预测GBM患者总体生存有价值，而对 预测胶质瘤复发没有意义。而Li等^[5]研究发现：恶 性脑胶质瘤患者中EphA2呈阴性或弱阳性表达者生 存期显著长于EphA2呈强阳性或阳性表达的患者， 认为EphA2对于预测恶性胶质瘤患者总体生存期和 肿瘤复发均有意义。本研究也发现EphA2阳性表达 和高表达组患者的生存率明显低于阴性表达和低 表达组，与Li等^[5]的结果相一致。

尽管EphA2对于恶性脑星形细胞瘤患者的预后 评估有显著价值，但在本组病例中也发现少部分 EphA2呈阳性表达的病例预后却较好，提示依靠 EphA2单因素预测患者预后并不完善。ephrinAl作 为EphA2的主要配体，可通过调控EphA2的表达诱 导肿瘤恶性表型^[11]。Li等^[5]研究结果显示ephrinAl 呈不同水平表达的患者总生存期和无进展生存期 差异无统计学意义，认为ephrinAl并非恶性脑胶质 瘤预后的相关因子，而本研究Kaplan-Meier生存分 析及Log rank检验显示ephrinA1阳性表达患者的生 存率明显高于阴性表达组，Cox风险模型生存分析 显示ephrinA1是胶质瘤风险因子，其表达越低， 生存期越短，具有预后意义，这与Li等^[5]的结果 显著不同。本组星形细胞瘤标本呈EphA2阳性、 ephrinAl阴性表达模式的患者预后显著差于标本呈 EphA2、ephrinAl其他表达模式的患者,笔者认为 将EphA2和ephrinAl作为共同指标用于评估恶性脑 星形细胞瘤患者的预后更有意义。相关研究^[12]也 充分显示EphA2和ephrinAl相互作用、共同影响肿 瘤生物学特性，并证实ephrinAl和EphA2可作为宫 颈癌、卵巢癌等恶性肿瘤的共同预后判断指标。

MVD是目前公认的最能反映血管形成能力、 作用最直接的因子。大多数研究认为高表达的 MVD值提示肿瘤更易于发生转移，是预后不佳的 指标。研究表明CD105仅在处于增殖状态的肿瘤组 织血管内皮细胞上强表达，在新生血管生成中是 必需的，是血管内皮细胞增殖的理想标志之一^[13]。 因此本实验采用CD105标记MVD值。生存分析显 示，MVD是星形细胞瘤风险因子，其表达越高， 生存期越短，MVD阳性表达和高表达组患者的生 存率明显低于阴性表达和低表达组，其相对危险 度仅次于EphA2，具有重要预后意义。张晓飞等^[14] 研究认为MVD具有很好的指示预后能力，可以作 为非小细胞肺癌及食管癌的独立预后因子。朱燕 等^[15]也报道MVD值与肿瘤的分期、增殖转移、生 存期显著相关，可以作为独立的预后指标，而且 本研究中EphA2阳性表达组的MVD值明显高于阴 性表达组；ephrinA1阴性表达组的MVD值明显高 于阳性表达组，说明EphA2高表达及ephrinA1低表 达的胶质瘤中，血管生成更为活跃。

因此，EphA2、MVD和 ephrinA1均是重要的 恶性脑胶质瘤预后相关风险因子，EphA2阳性表 达、MVD值增高、ephrinA1阴性表达均将提示胶 质瘤死亡的风险增加，均具有重要的预后意义。同 时检测EphA2、MVD和ephrinAl的表达对于评估患 者预后和指导术后放、化疗方案的选择具有重要 意义，可能为胶质瘤的个体化治疗指明新的出路。