HOXA7是同源盒基因(homeobox gene,HOX) 家族中一员，在造血系统发育过程中起重要调 控作用，随造血细胞CD34+向CD34-分化成熟， HOXA7表达下调^{[ 1 ]}。在特定造血谱系分化阶段，HOXA7过表达能导致白血病发生，且其过表达 与白血病患者对治疗的反应及预后差密切相关。 RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术因能在转 录后水平沉默某些功能基因，近年来在白血病研 究中得到广泛应用。本实验在构建靶向HOXA7特 异性真核表达载体基础上，运用RNA干扰技术抑 制白血病细胞株U937中HOXA7表达后，研究其对 U937细胞增殖、凋亡的影响，为白血病基因治疗 寻找新靶点。 1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂

人单核细胞白血病细胞株U937（滨州医学院 肿瘤分子生物学重点实验室提供），RPMI 1640 培养液、胎牛血清（美国Hyclone公司）；DNA 连接酶、DNA内切酶BbsⅠ、BamHⅠ、 PstⅠ、 反转录试剂盒（加拿大Fermentas公司）；质粒 中量抽提试剂盒（爱思进生物技术有限公司）； X-tremeGENE HP DNA转染试剂（Roche公司）； RNAiso Plus总RNA提取试剂、PCR反应试剂盒 （日本TAKARA公司）；MTT细胞增殖及细胞 毒性检测试剂盒、RIPA裂解液（碧云天生物技术 有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物公 司）；兔抗人β-actin多克隆抗体（巴傲得生物科技 有限公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（中杉金桥 生物有限公司）；兔抗人HOXA7多克隆抗体（博 士德生物有限公司）；HOXA7和内参β-actin引物 （赛百盛生物技术有限公司）。 1.2 方法 1.2.1 靶向HOXA7特异性真核表达载体的构建 1.2.1.1 shRNA的设计、合成

根据前期实验成 功筛选出的沉默HOXA7效率最高的一对siRNA （small interfere RNA,siRNA），引物序列为：正 义链5'-CCTCCTACGACCAAAACAT-3' ，反义链 5'-ATGTTTTGGTCGTAGGAGG-3'，设计相应短 发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），命名为 shHOXA7，同时设计与HOXA7及人类基因组无同 源性的阴性对照shNC，shRNA模板序列由上海吉 玛公司合成，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 设计合成的shHOXA7和shNC序列 Table 1 Sequences of shHOXA7 and shNC

表 1 设计合成的shHOXA7和shNC序列 Table 1 Sequences of shHOXA7 and shNC

取溶解后的shRNA正义链、 反义链各5 μl、10×shDNA Annealing Buffer 5 μl、 灭菌水35 μl配成退火反应液，按下列程序进行退火 反应：95ºC 5 min，85ºC 5 min，75ºC 5 min，70ºC 5 min，得到双链shRNA模板，用于连接反应。 1.2.1.3 酶切

将pGPU6/GFP/Neo载体用内切酶 BbsI和BamHI 37ºC酶切1 h，琼脂糖电泳后进行凝 胶回收，用于连接反应。 1.2.1.4 连接

取退火后的双链shRNA模板和酶切 后载体按摩尔比3:1比例，由T4 DNA连接酶在22℃ 连接1 h。 1.2.1.5 转化

将连接产物转化感受态细胞DH5α， 取200 μl转化后的DH5α均匀涂布于含卡那霉素 （50 μg/ml）的LB培养板上，于37℃培养箱中培 养过夜筛选阳性克隆重组质粒载体。 1.2.1.6 鉴定

从LB培养板上挑取阳性克隆，接 种于含卡那霉素（50 μg/ml）的LB培养液中，37℃ 恒温摇床培养16 h，抽提质粒，用BamHⅠ,PstⅠ 分别酶切鉴定，酶切正确的交上海英俊生物公司 进行测序，测序正确的菌株进行高纯度提取，分 别命名为pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7和阴性对照 pGPU6/GFP/Neo-shNC。 1.2.2 U937细胞培养

人白血病细胞株U937在10%胎牛血清和青霉素 （浓度为100 u/ml）、链霉素（浓度为0.1 mg/ml） 双抗的完全培养液中，置于37℃、5%CO₂培养箱 中培养，根据细胞生长状况，2~3天传代一次，取 对数生长期细胞进行后续实验。 1.2.3 U937细胞转染

将对数生长期U937细胞接种于细胞培养板 上。实验分3组：空白对照组（不加转染试剂和 质粒载体）、阴性对照组（加转染试剂和pGPU6/ GFP/Neo-shNC）、实验组（加转染试剂和pGPU6/ GFP/Neo-shHOXA7），根据X-tremeGENE HP DNA转染试剂说明书，优化转染条件，pGPU6/ GFP/Neo-shHOXA7和pGPU6/GFP/Neo-shNC分别 用不含抗生素和血清的RPMI 1640培养液稀释，混 匀后取X-tremeGENE HP DNA转染试剂加入稀释好 的重组载体中，混匀后室温孵育30 min，小心将混 合物加到U937细胞中，置于37℃、5%CO₂培养箱 中培养，24~72 h后进行相关指标检测。 1.2.4 RT-PCR检测HOXA7 mRNA表达情况

取对数生长期的U937细胞，以6×10⁵个/孔接 种于6孔板，根据1.2.3分组及方法进行转染，转染 24 h后，收集细胞，提取细胞总RNA，测定RNA 纯度及浓度，两步法进行RT-PCR。所用引物序 列如下：HOXA7 正义链 5'-ACC GAC ACT GAA AGC TGC CG-3'，反义链 5'-AGG TCC TGA AGA CCG CAT CC-3'，扩增长度为410 bp。β-actin 正义 链5'-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3'，反义链 5'-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3'，扩增长度 为268 bp。按下列条件进行RT-PCR反应：95℃预 变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延 伸30 s，共进行35个循环；72℃延伸10 min。实验 重复3次。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，采 用Tanon Gel凝胶图像分析软件分析，以HOXA7与 β-actin的灰度比值表示HOXA7相对表达量，计算 实验组对HOXA7的抑制率。HOXA7 抑制率=[1-实 验组（HOXA7相对表达量）/空白对照组（HOXA7 相对表达量）]×100% 1.2.5 Western blot检测HOXA7蛋白表达情况

取对数生长期U937细胞，以6×10⁵个细胞/孔 接种于6孔板，根据1.2.3分组及方法进行转染，转 染48 h后，收集细胞，RIPA+PMSF裂解抽提细胞 总蛋白，取40 μg蛋白进行10%SDS-PAGE电泳分 离，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，用含7%脱 脂奶粉的TBST封闭2.5 h，加兔抗人HOXA7多克隆 抗体（稀释度为1 : 100），4℃摇床过夜，经TBST充 分漂洗，加辣根酶标记山羊抗兔二抗（稀释度为1:5 000），室温摇床上放置2 h后洗膜，化学发光法显 色。用β-actin（稀释度为1 : 3 000）作内参重复以 上步骤。实验重复3遍。采用Chemiscope软件分析 图像，以HOXA7与β-actin的灰度比值表示HOXA7 相对表达量，计算实验组对HOXA7的抑制率。 HOXA7 抑制率=[1-实验组（HOXA7相对表达量） /空白对照组（HOXA7相对表达量）]×100% 1.2.6 MTT法检测细胞的增殖能力

取对数生长期U937细胞，以3×10⁴个/孔接种 于96孔板，根据1.2.3分组及方法进行转染，每组 设5个平行孔，分别于转染24、48、72 h后，每 孔加入MTT 20 μl（5 mg/ml），继续置于37℃、 5%CO₂培养箱中培养4 h，离心后小心吸出孔中 培养液，每孔加DMSO 150 μl，摇床上避光振荡 15~20 min，酶标仪检测各孔在560 nm处的吸光度 值（A560），5个平行孔取平均值计算各组细胞增 殖抑制率（inhibitory rate，IR），分别检测转染 24、48、72 h后各组细胞IR，实验重复3次。Ir= （1-实验组A560/空白对照组A560）×100%。 1.2.7 流式细胞术检测细胞的凋亡情况

取对数生长期的U937细胞，以6×10⁵个/孔接种 于6孔板，根据1.2.3分组及方法进行转染，转染48 h 后离心收集细胞（2 000 r/min离心5 min），用PBS 洗涤细胞2次（2 000 r/min离心5 min）收集，加入 500 μl Binding Buffer悬浮细胞，加Annexinⅴ-FITC 和 Propidium Iodide（PI）各5 μl后混匀，室温避光 反应15 min后流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率， 实验重复3次。 1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行数据统计分析，结 果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析， 多组间两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统 计学意义。 2 结果 2.1 酶切鉴定重组质粒

退火后的双链shRNA模板与酶切后的载体 pGPU6/GFP/Neo连接形成重组质粒，挑取2个单 克隆，分别用内切酶BamHⅠ和PstⅠ进行酶切鉴 定，由于载体pGPU6/GFP/Neo的BbsⅠ和BamHⅠ 酶切位点之间是PstⅠ的酶切位点，重组质粒因目 的基因的插入，PstⅠ酶切位点被取代，因此不能 被内切酶PstⅠ切开，重组载体因保留了BamH Ⅰ 酶切位点，因此能被内切酶BamHⅠ切开，酶切 后显示出一条约5 100 bp的条带，插入目的基因条 带太小（约60 bp）不能显示，见图 1。鉴定正确 的2个菌株进行测序，测序结果显示插入的目的片 段序列正确，证明重组质粒载体pGPU6/GFP/NeoshHOXA7 构建成功。

1 and 2(left) digested by BamHⅠ;1 and 2(right) digested by PstⅠ;M: DNA marker 图 1 pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7重组载体酶切鉴定 Figure 1 Identification of pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7 recombination vector by restriction enzyme digestion

RT-PCR检测各组细胞中HOXA7 mRNA相对 表达量分别为：实验组(66.946±7.249)%、阴性 对照组(117.797±8.855)%、空白对照组(127.536± 6.193)%，实验组与空白对照组和阴性对照组相比 差异均有统计学意义（P<0.05），而阴性对照组 与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。实 验组HOXA7 mRNA相对表达量明显低于阴性对照 组和空白对照组，抑制率为(47.314±7.394)%，见图 2。

1:blank control group;2:negative control group;3:experimental group; M:marker 图 2 RT-PCR检测各组细胞HOXA7 mRNA表达情况 Figure 2 The expression of HOXA7 mRNA in each group detected by RT-PCR

Western blot检测各组细胞中HOXA7蛋白相对 表达量，实验组[(39.339±4.706)%]明显低于阴性 对照组[(75.665±7.090)%]和空白对照组[(83.344± 5.883)%](P<0.05)，抑制率为(52.371±9.258)%，而 阴性对照组和空白对照组HOXA7蛋白相对表达量 相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图 3。

1:blank control group;2:negative control group;3:experimental group 图 3 Western blot检测各组细胞HOXA7蛋白表达情况 Figure 3 The expression of HOXA7 protein in each group detected by Western blot

重组质粒载体转染U937细胞24、48、72 h后， MTT法检测各组细胞增殖情况，各时间点实验组 与阴性对照组和空白对照组IR相比，差异有统计 学意义（P<0.05），且随时间延长，实验组细胞 IR增加，细胞增殖受抑制效果越明显。而各时间 点阴性对照组和空白对照组IR相比，差异无统计 学意义(P>0.05) ，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 不同时间点各组细胞增殖抑制情况 Table 2 The proliferation inhibition rate of each group cells at different time points Notes:1:blank control group;2:negative control group;3:experimental group;IR:inhibitory rate;★:compared with blank control group; ▲:compared with experimental group;◆:compared with blank control group

表 2 不同时间点各组细胞增殖抑制情况 Table 2 The proliferation inhibition rate of each group cells at different time points

流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况，空 白对照组、阴性对照组和实验组细胞凋亡率分 别为(5.067±0.983)%、(6.743±1.075)%、(24.677± 4.161)%，其中，实验组明显高于空白对照组和阴 性对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），空 白对照组和阴性对照组相比，差异无统计学意义 （P>0.05），见图 4。

A: blank control group;B: negative control group;C:experimental group 图 4 流式细胞术检测各组细胞凋亡率的情况 Figure 4 The apoptosis rate of each group cells detected by fl ow cytometry

白血病发病率在儿童恶性肿瘤中占首位，随 生物学技术发展，白血病基因治疗逐渐成为根治 白血病的新方案，近年来受到广泛关注。在造血 细胞增殖分化过程中，HOX基因家族通过与靶基 因特异性结合发挥重要调控作用。Wheadon等^{[ 2 ]} 运用鼠胚胎干细胞体内分化模型研究发现，HOX 基因以剂量依赖性在造血调控过程中发挥主导作 用，随造血分化，大多数HOX基因表达下调， 而白血病原癌基因Tel/PDGFRβ短暂诱导能引起 HOXA7等HOX基因异常表达，从而引发白血病。 Argiropoulos等^{[ 3 ]}发现，MEIS1作为HOX基因的辅 因子，能加速反转录病毒介导多种HOX基因过表 达导致白血病的发生，提示包含HOXA7在内的 HOX基因通路调控异常与白血病发生密切相关。

HOXA7异常高表达在白血病发生发展、信号 转导、治疗及预后等方面均发挥了重要作用。许 多白血病相关融合基因（如混合谱系白血病基因 MLL、核孔蛋白NUP98等）通过上调其转录靶标 HOXA7导致白血病发生^{[ 4, 5, 6 ]}。Afonja等^{[ 7 ]}检测了14 种人类髓系白血病细胞系中HOXA7的表达情况， 发现GDM-1、THP-1、MOLM-9等10种白血病细胞 系中均高表达HOXA7，进一步研究HOXA7在白血 病患者中的表达情况显示，50%AML患者骨髓细 胞中高表达HOXA7，且高表达HOXA7的患者经传 统化疗后很难达到临床缓解，提示HOXA7高表达 与白血病发生、白血病患者对化疗的反应差密切 相关，因此，抑制HOXA7高表达有望成为白血病 基因治疗的新方法。

RNAi是由外源性和内源性双链RNA介导的， 能够特异性降解其同源mRNA，并抑制相应基因 表达的技术。RNAi以siRNA为工具沉默致病基 因。目前制备siRNA的方法主要有以下4种：(1) 直接化学合成siRNA；(2)体外转录合成siRNA； (3)用RNaseⅢ消化长片段双链RNA得到siRNA； (4)利用质粒或病毒载体表达siRNA，质粒或病毒 载体转染细胞后可以稳定表达，因而得到广泛应 用。本实验通过设计合成质粒载体pGPU6/GFP/ Neo-shHOXA7，并转染U937细胞，转录出相应 shRNA，shRNA在胞内被Dicer酶剪切成siRNA而 发挥抑制HOXA7的作用，RT-PCR和Western blot分 别检测pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7在mRNA和蛋白 水平对HOXA7的抑制率分别达(47.314±7.394)%和 (52.371±9.258)%，该载体的成功构建为靶向RNAi 抑制HOXA7高表达方面的研究奠定了实验基础。

目前国内外对RNAi抑制HOXA7对白血病影 响的研究较少。Orlovsky等^{[ 8 ]}在NOD/SCID小鼠中 研究发现，在双表型白血病细胞株RS4:11中沉默 HOXA7后能阻碍白血病细胞在骨髓中的植入，并 抑制白血病细胞在小鼠体内增殖。本实验MTT结 果显示，RNAi抑制HOXA7表达后U937细胞增殖 明显受抑，且随时间延长，抑制效果越明显，这 与Gessner等^{[ 9 ]}研究的siHOXA7沉默HOXA7表达后 通过抑制端粒酶转录和端粒酶反转录酶TERT活性 从而抑制白血病细胞增殖的结论相同。本实验运 用流式细胞术检测各组细胞凋亡率，发现RNAi抑 制HOXA7表达后，与阴性对照组和空白对照组相 比，实验组白血病细胞U937的凋亡率明显增加。 因此，RNAi抑制HOXA7高表达能有效抑制白血病 细胞增殖并促进其凋亡，HOXA7有望成为白血病 基因治疗的新靶点。