氯化锂（lithium chloride,LiCl）是治疗躁郁 型精神障碍的主要药物，是糖原合成酶激酶-3 （GSK-3）的抑制剂。大量研究显示，氯化锂在人体多个系统中具有广泛的生理调节作用，在神经 变性、糖尿病、中风、肿瘤、慢性炎症等疾病中 有一定的治疗意义^{[ 1 ]}；在造血系统中能增强造血干 细胞的自我更新和增殖分化能力，临床上用于放 化疗后造血系统的恢复^{[ 2 ]}，相关机制研究发现，这 些作用均与其对GSK-3的抑制密切相关^{[ 3 ]}。但氯化 锂对白血病细胞THP-1的作用，目前尚未见报道， 本文研究了氯化锂对THP-1细胞增殖、凋亡、周期 的影响，并初步观察了氯化锂作用后细胞内Wnt通 路的变化情况。 1 材料与方法 1.1 材料

人THP-1白血病细胞株购自美国ATCC公司。 RPMI1640培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清 购自杭州四季青公司。氯化锂购自美国Sigma公 司。噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、 碘化吡啶（PI）购于美国Sigma公司。Annexin V-FITC/PI双染试剂盒购自南京凯基生物公司。 GSK3β、P-GSK3β（Ser9）、β-catenin、c-myc、 cyclinD1兔抗人单克隆抗体均购自美国C e l l Signaling公司，GAPDH鼠抗人单克隆抗体购自美 国Epitomics公司。皮克级化学发光底物试剂盒购 自美国Thermo公司。 1.2 细胞增殖MTT实验

将细胞（1×10⁴ /ml）接种于96孔板，200微升 /孔，加入终浓度为0、2、 4、 8、 16、 32、64及 128 mM/ml的氯化锂，以不加细胞和药物的培养 基为空白对照，每组设4个平行复孔。分别于培养 后24、48、72、96 h后，每孔加入5 mg/ml MTT20 μl，继续培养4 h，离心去除上清，每孔加入200 μl DMSO，振荡溶解，酶标仪492 nm波长处测吸光 度（A），按如下公式计算抑制率。

抑制率%=[1- ( A_实验组 - A_{空白对照组} ) / (A_{阴性对照组} - A_{空白对照组} )]×100% 1.3 流式细胞术检测细胞凋亡

氯化锂各浓度作用THP-1细胞24、48 h后，收 集细胞，PBS洗涤两次后，取1×10⁶细胞，用500 μl 的Binding Buffer重悬，加入2 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，混匀，室温避光反应15 min后，于1 h内上 机检测。 1.4 流式细胞术检测细胞周期分布

收集氯化锂各浓度处理24、48 h细胞，PBS洗 涤两次，取5×10⁵细胞离心后沉淀物，加入70%冰 乙醇-20℃过夜。离心去上清，沉淀用200 μlPBS 重悬，加入20 μlRNA酶，室温5 min，再加入50 μl PI，室温避光20 min，于1 h内上机检测。 1.5 Wnt通路的Western blot检测

收集氯化锂各浓度处理4、12、24、48 h的细 胞，用RIPA蛋白裂解液提取收集细胞蛋白质，用 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取80 μg变性后蛋白 样品上样于10%SDS-PAGE，电泳后冰浴电转至 PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入各一 抗抗体4℃孵育过夜。TBS洗膜后，加入荧光二抗 室温孵育1 h。TBS洗膜，用皮克级化学发光底物 试剂盒进行曝光显影。 1.6 统计学方法

结果数据以均数±标准差(±s)表示，应用 GraphPad Prism 5.0 软件进行统计分析，t检验分析 实验组和对照组之间差异，以P<0.05为差异具有 统计学意义。 2 结果 2.1 氯化锂对THP-1细胞增殖的影响

MTT法检测显示，8~128 mM/ml氯化锂作 用THP-1细胞24、48、72、96 h，其抑制率均 明显高于对照组（8 mM/ml24、48、72 h时， P=0.0079、P=0.0079、P=0.0076；8 mM/ml作用 96 h以及16~128mM/ml 作用24、48、72、96 h，P 均<0.0001），且抑制率随浓度增大和时间延长而 增加。当4 mM/ml氯化锂作用白血病THP-1细胞96 h，其抑制率也明显高于对照组（P=0.0002，）， 见图 1。

图 1 氯化锂对THP-1细胞增殖的影响 Figure 1 Effects of LiCl on proliferation of THP-1 cells

以流式散点图右下象限的早期凋亡细胞与 右上象限的晚期凋亡细胞之和表示总凋亡率。 结果显示，氯化锂8 mM/ml作用24 h，细胞凋 亡率与对照组相比，差异无明显统计学意义 （P=0.0908），而作用48 h后，细胞凋亡率明显高 于对照组（P=0.023）；24和48 mM/ml氯化锂分别 作用24、48 h，细胞凋亡率明显高于对照组（24 mM/mL作用24、48 h ，P=0.013、P=0.0007，48 mM/ml作用24、48 h，P=0.0067、P=0.0007）；且 48mM/ml氯化锂作用48 h与作用24 h相比，凋亡率 明显增高，差异有统计学意义（P=0.0066），见 表 1、图 2。

表 1(Table 1)

表 1 流式细胞术检测氯化锂作用THP-1细胞后的凋亡率(±s, n=3) Table 1 Effects of LiCl on apoptosis rates of THP-1 cells detected by fl ow cytometry(±s,n=3) Notes:*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,compared with corresponding control (0mM/ml); △:P<0.05,△△:P<0.01,compared with 48mM/ml LiCl for 24h

表 1 流式细胞术检测氯化锂作用THP-1细胞后的凋亡率(±s, n=3) Table 1 Effects of LiCl on apoptosis rates of THP-1 cells detected by fl ow cytometry(±s,n=3)

A,B,C,D: 0,8,24,48mM/ml treatment for 24h,respectively; E,F,G,H: 0,8,24,48mM/ml treatment for 48h,respectively 图 2 THP-1细胞经氯化锂处理后的凋亡检测 Figure 2 Effects of LiCl on apoptosis of THP-1 cells

流式细胞术检测细胞周期分布，结果显示： 氯化锂8 mM/ml作用细胞24 h，细胞周期变化不 明显（G₀/G₁期P=0.1543，S期P=0.514，G₂/M期 P=0.2887），8 mM/ml作用48 h、24和48 mM/ml 分别作用24和48 h，与对照组相比，G₀/G₁期细胞 比例明显减少（8 mM/ml作用48 h，P=0.0003， 24 mM/ml作用24、48 h，P=0.0214、P=0.0003； 48 mM/ml作用24、48 h，P=0.0161、P=0.0001）， G₂/M期细胞比例明显增多（8 mM/ml作用48 h， P=0.0427；24 mM/ml作用24、48 h，P=0.0446、 P=0.0283；48 mM/ml作用24、48 h，P=0.0081、 P=0.0017），S期细胞比例变化不明显（8 mM/ml 作用48 h，P=0.2997；24 mM/ml作用24、48 h， P=0.3058、P=0.1587；48 mM/ml作用24、48 h， P=0.8481、P=0.1404）；48 mM/ml作用细胞48 h和 作用24 h相比，G₀/G₁、G₂/M期细胞比例均差异显 著（P=0.0331，P=0.0297）。提示氯化锂将THP-1 细胞阻滞于G₂/M期，且浓度越大、时间越长，阻 滞越明显,见表 2、图 3。

表 2(Table 2)

表 2 流式细胞术检测氯化锂作用THP-1细胞后的周期分布 (±s,n=3) Table 2 Effects of LiCl on cell cycle of THP-1 cells detected by fl ow cytometry(±s,n=3) Notes:*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,compared with corresponding control (0mM/ml); #:P<0.05,compared with 8 mM/ml of LiCl for 24h;▲: P<0.05,compared with 24mM/ml of LiCl for 24h; △:P<0.05,compared with 48 mM/ml of LiCl for 24h

表 2 流式细胞术检测氯化锂作用THP-1细胞后的周期分布 (±s,n=3) Table 2 Effects of LiCl on cell cycle of THP-1 cells detected by fl ow cytometry(±s,n=3)

A,B,C,D: 0,8,24,48mM/ml treatment for 24h,respectively; E,F,G,H: 0,8,24,48mM/ml treatment for 48h,respectively 图 3 THP-1细胞经氯化锂处理后的周期检测 Figure 3 Effects of LiCl on cell cycle of THP-1 cells

氯化锂8、24、48 mM/ml作用于THP-1细胞4、 12、24、48 h，用Western blot检测Wnt通路各蛋白 表达情况，结果显示，与对照组相比，t-GSK3β在 各浓度各时间作用下，表达基本不变；p-GSK3β表 达升高；β-catenin随浓度增加和时间延长而升高； 氯化锂各浓度作用4和12 h时，β-catenin下游c-myc 表达升高，8和24 mM/ml作用24h，以及8 mM/ml作 用48 h时，c-myc蛋白表达也升高，而在48mM/ml作 用24 h，24和48 mM/ml作用48 h时，c-myc蛋白表达 则下调；β-catenin下游另一蛋白cyclinD1则在氯化 锂各浓度各时间作用下表达变化不明显，见图 4。

图 4 Western blot检测THP-1细胞经氯化锂作用后Wnt信号通路的变化 Figure 4 Effects of LiCl on expressions of Wnt signaling pathway proteins in THP-1 cells

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是一种多功能 丝/苏氨酸蛋白激酶，普遍存在于所有真核细胞 生物，在多个信号转导通路中扮演重要角色，影 响细胞的基因表达、蛋白合成、糖原代谢以及增 殖、凋亡等生理过程，GSK-3的异常调节可能导 致糖尿病、心血管疾病、神经精神疾病等多种人 类疾病的发生^{[ 4 ]}。以及肿瘤的发生与进展，其对肿 瘤调控最重要的一条途径是参与Wnt/β-catenin信号 通路。Wnt通路活化能抑制 GSK-3活性，使胞浆 内β-catenin水平升高并发生核转移，进入胞核的 β-catenin与转录因子TCF/LEFs结合，从而刺激下 游促癌基因（c-myc、cyclinD1、MMP-7）的高表 达，由此推测，抑制GSK-3可能促进肿瘤生长^{[ 5 ]}。 但是，事实并非如此，有研究证实，在GSK3β缺 失的小鼠中，β-catenin和cyclinD1水平并不升高； 在结肠腺瘤性息肉病基因(APC)突变的小鼠中使用 GSK-3抑制剂氯化锂并不能导致肿瘤的发生；还有 研究表明长期使用氯化锂治疗精神疾病的人群肿 瘤发生率低于普通人群。因此，GSK-3对肿瘤是促 进还是抑制，目前仍存争议，一方面，GSK-3通 过对β-catenin的调节抑制肿瘤发生，但另一方面， GSK-3抑制剂却并不增加肿瘤发生率，相反对肿 瘤有一定的抑制作用，这可能与GSK-3参与除Wnt/ β-catenin通路以外的其他调节途径有关^{[ 6 ]}。

多个研究表明，在血液系统恶性肿瘤，如慢 性粒细胞白血病（CML）、急性淋巴细胞白血病 （ALL）和急性髓系白血病（AML）中，均能检 测到Wnt通路的活化^{[ 7 ]}。也有文献报道，GSK-3 抑制剂BIO对白血病细胞系有生长抑制作用^{[ 8, 9 ]} ， GSK-3是急性髓系白血病（AML）一个潜在的治 疗靶点^{[ 10 ]}。然而，GSK-3抑制剂氯化锂对白血病 细胞系THP-1的生长以及细胞内Wnt通路的影响， 目前还未有相关研究。本实验中，氯化锂能抑制 THP-1细胞的增殖，且具有浓度和时间依赖性， 流式细胞术检测发现，不同浓度的氯化锂作用于 THP-1细胞24和48 h，细胞凋亡率均明显高于对照 组。此外，氯化锂对THP-1细胞的周期影响显著， 在不同浓度和时间的处理下，细胞阻滞于G₂/M 期，S期变化不明显，G₀/G₁期细胞相对减少。对细 胞内Wnt通路进行Western blot检测，可以发现，不 同浓度氯化锂分别作用THP-1细胞4、12、24、48 h，Wnt通路活化，β-catenin随着作用时间和浓度 的增加表达明显升高，其下游c-myc蛋白在作用时 间短，浓度低时表达升高，但随着作用时间的延 长和浓度的增加，其表达也逐渐降低，而另一下 游分子cyclinD1则表达不变。

由此推测，在THP-1细胞中，氯化锂有效抑 制了GSK-3的活性，使得Wnt通路活化，β-catenin 升高，在短时间和低浓度情况下，促进下游靶基 因c-myc的表达，使得c-myc水平升高，c-myc是 细胞周期和凋亡相关蛋白，能促进细胞进入细胞 周期和发生凋亡^{[ 11,12 ]} ,因此在本实验中，氯化锂短 时间低浓度的刺激即可促进THP-1细胞从G₀/G₁期 进入G₂/M期，并同时发生凋亡。然而，随着作用 时间和浓度的增加，抑制GSK-3可能通过其他途 径抑制c-myc表达，从而使得c-myc下调，细胞发 生周期阻滞和凋亡^{[ 13,14 ]} ，因此THP-1细胞被阻滞 于G₂/M期，凋亡亦可同时发生。作为重要的肿瘤 调控蛋白^{[ 15 ]}，c-myc的表达变化可能是氯化锂抑 制白血病细胞THP-1生长的机制之一。另外，当 β-catenin升高，cyclinD1可能受其调控升高，但同 时，抑制GSK-3也能抑制NF-κB途径，使其下游 的cyclinD1下调，因此，氯化锂作用THP-1细胞可 能导致cyclinD1表达水平不变^{[ 5,6 ]}。 当然，c-myc和 cyclinD1参与了细胞复杂的周期和凋亡调控系统， 氯化锂对THP-1细胞周期和凋亡的影响尚不能仅通 过c-myc和cyclinD1的变化来解释，还有待进一步 的研究。

总之，虽然GSK-3对肿瘤的调控机制尚不明 朗，但本实验证明了GSK-3抑制剂氯化锂能抑制 白血病细胞THP-1的生长，促进细胞凋亡和诱导 G₂/M期阻滞，发挥抗白血病作用，为进一步探索 氯化锂在白血病中的作用机制，以及临床治疗白 血病的可行性提供了一定的研究基础。