多烯紫杉醇治疗前列腺癌易产生耐药性，大 部分患者接受治疗后发展成激素抵抗性或难治 性前列腺癌。DU145细胞为多烯紫杉醇耐药细胞株，且细胞表面高表达Somatostatin Receptor Subtype 2(SSTR2)和Subtype5 (SSTR5)受体。奥曲 肽主要是通过与靶细胞受体（SSTR）特异性结合 后，通过SSTR进行信号转导调控，进而调控靶细 胞的功能^[1]。奥曲肽具有抑制细胞增殖、诱导凋亡 和抗肿瘤的作用，且临床应用不良反应小。本实 验通过采用多烯紫杉醇与奥曲肽联合应用对前列 腺癌DU145细胞的体外肿瘤抑制作用研究，旨在 探讨奥曲肽对多烯紫杉醇耐药人前列腺癌DU145 细胞株药物敏感度的影响及可能的机制，为临床 治疗提供依据。 1 材料与方法 1.1 材料

前列腺癌细胞DU145由美国弗雷德癌症 研究中心（FHCRC）惠赠。多烯紫杉醇购自 Sigma公司，奥曲肽（善宁）购自诺华公司。 DMEM/F12 1:1高糖培养液与胎牛血清购自 Thermo公司。RNA反转录试剂盒购自Fermentas life science公司。引物由苏州金唯智生物科技有 限公司合成。引物序列（5′----3′）CASP3-F： CTCATACCTGTGGCTGTGTATC，CASP3-R GCTCCTTTTGCTGTGATCTTC 498 bp。 ACBC1-F GTCGGAATGGATCTTGAAGGG， ACBC1-R ACATCAAACCAGCCTATCTCC 500 bp。CASP9-F AGAGATTCGCAAACCAGAGG， CASP9-R CAAGATAAGGCAGGGTGAGG 493 bp。VEGFA-F CCGAAACCATGAACTTTCTGC， VEGFA-R CCTTTCCCTTTCCTCGAACTG 456 bp。β-actin-F AAGGGCCATCCACAGTCTTC， β-actin-R AGAAGGCTGGGGCTCATTG 250 bp。 1.2 方法 1.2.1 MTT法分别检测不同浓度多烯紫杉醇﹑奥 曲肽及不同浓度多烯紫杉醇与奥曲肽(100 nM)联合应用对DU145细胞的增殖抑制作用

消化细胞，制备单细胞悬液，接种于96孔 板，每孔3×10³个；待细胞贴壁后，加入不同浓度 DTX(5、10、20、50、100 nM)，不同浓度OCT （10、10²、10³、10⁴、0.5×10⁵ nM）及不同浓度 DTX与奥曲肽（100 nM）联合作用，每组5个复 孔，同时设不加药物为对照组及只加培养液的调 零孔。每孔终体积为200 μl，置37℃的CO2培养箱 继续培养；药物处理24 h后，取出一块培养板，弃 培养液，用PBS清洗两遍，每孔加MTT 20 μl,培养 液100 μl，继续孵育4 h。去上清液，每孔加DMSO 150 μl，孵育15 min；摇床混匀10 min，酶标仪450 nm测各孔的吸光值，计算抑制率。同样方法分别 检测48 h及72 h的OD值。细胞增殖抑制率=[1-（实 验组OD值-调零孔OD值）/(对照组OD值-调零孔 OD值)]×100％。实验重复三次根据MTT结果后 续实验分四组：空白对照组﹑DTX组﹑DTX/OCT 组及DTX组，DTX浓度为10 nM，OCT浓度为100 nM。 1.2.2 RT-PCR检测各组细胞VEGF AmRNA﹑ Caspase9 mRNA﹑Caspase3 mRNA及ABCB1 mRNA的表达

实验分组同上，各组药物处理24 h后使用 Trizol总RNA提取试剂盒提取各组RNA，反转录 成cDNA，按以下条件进行PCR反应：预变性94℃ 5 min；变性 94℃ 30 s；退火 55℃~60℃ 45 s； 延伸，共30~35个循环，72℃ 45 s 。最终延伸， 72℃ 7 min。琼脂糖凝胶电泳：取5 μl PCR产物与 2 μl 6×loadding buffer溶液混匀后加入到琼脂糖凝 胶梳孔内，另将DNA Maker上样至其他孔内。90 V 电压条件下电泳（20~25）min，在凝胶成像扫描仪 中观察琼脂糖凝胶，并拍照。Quantity one分析软件 测得其灰度值，以目的条带/β-actin mRNA条灰度比 值计算，实验重复三次，结果以均数±标准差表示。 1.2.3 划痕实验检测人前列腺癌DU145各组细胞 迁移能力

用记号笔在六孔板背后划线，每隔1 cm一道 线，每孔至少穿过三条线，消化细胞铺板。细胞 密度长到80％~90％时，用10 μl枪头垂直六孔板背 后横线划痕。弃旧培养液，PBS洗三遍，加入2％ 培养液及药物，实验分组同上。倒置显微镜下观 察，24 h后照相记录各交叉点结果，实验重复三 次。 1.3 统计学方法

实验数据以均数±标准差（±s）表示，根据 实验设计选择完全随机设计的单因素方差分析和t 检验比较均值差异性。所有数据统计均采用SPSS 12.0统计软件完成。所有作图均采用GraphPad Prism 5.0软件完成。 2 结果 2.1 奥曲肽与多烯紫杉醇及联合用药对细胞生长 的抑制作用

不同浓度的DTX(5 nM~100 nM)对DU145细胞 的增殖均有明显抑制作用，随着浓度和时间的增 高抑制作用均增大，100 nM DTX在72 h节点能完 全抑制DU145细胞的增殖。提示DTX对DU145细胞 抑制作用具有时间剂量依赖性。多烯紫杉醇处理 细胞72 h的IC₅₀值为(24.55±0.36) nM，见表 1、图 1。

表 1(Table 1)

表 1 多烯紫杉醇对DU145细胞的增殖影响 Table 1 Effects of docetaxel on DU-145 cell proliferation Notes:*:P<0.05,compared with control and other DTX groups；▲▲: P<0.01，▲:P<0.05,compared with 24 h； ▼▼:P<0.01,compared with 24，48 h;▼:P<0.05,compared with 24 h

表 1 多烯紫杉醇对DU145细胞的增殖影响 Table 1 Effects of docetaxel on DU-145 cell proliferation

图 1 多烯紫杉醇不同浓度及时间对DU145细胞的增殖影响 Figure 1 Effects of docetaxel at different concentrations and time on DU-145 cell proliferation

OCT（10~0.5×10⁵ nM）单独应用时对细胞具 有一定的抑制作用，OCT在10 nM至10⁴ nM浓度 范围内，对细胞的抑制作用没有明显的剂量依赖 性，具有时间依赖性，见图 2﹑表 2。0.5×10⁵ nM的 OCT对DU145细胞的抑制作用非常明显，镜下可 观察到细胞凋亡。

图 2 奥曲肽不同浓度及时间对DU145细胞的增殖影响 Figure 2 Effects of octreotide at different concentrations and time on DU-145 cell proliferation

表 2(Table 2)

表 2 奥曲肽对DU145细胞的增殖影响 Table 2 Effects of octreotide on DU-145 cell proliferation Notes: **:P<0.01 ,compared with control groups； ▲▲:P<0.01 ,compared with 24 h；▼▼:P<0.01 ,compared with 24，48 h

表 2 奥曲肽对DU145细胞的增殖影响 Table 2 Effects of octreotide on DU-145 cell proliferation

DTX（5~100）nM与OCT（100 nM）联合应 用时抑制率均高于单独用药组抑制率，在72 h时 最明显，见图 3。联合用药72 h后，DU145对多 烯紫杉醇的IC₅₀与多烯紫杉醇组相比降低[(11.85± 0.25)vs.(24.55±0.36),（P﹤0.01）]。表明OCT增强 了DTX对DU145细胞的药物敏感度。OCT（100 nM）/DTX(10 nM)联合用药组细胞抑制率均高 于单独用药组，[(55.70±0.08)% vs.(26.23±0.03)%, (24.77±0.04) ％,(P﹤0.01)]，见图 4。

**:P<0.01,compared with DTX group 图 3 奥曲肽增强DU145细胞对多烯紫杉醇的敏感度 Figure 3 Octreotide enhanced the sensitivity of DU-145 cells to docetaxel

▲▲:P<0.01,compared with OCT(100)group;DTX(10)group 图 4 多烯紫杉醇与奥曲肽联合作用于DU-145细胞72 h的 抑制作用 Figure 4 Inhibitory effect of docetaxel and octreotide combinaton on DU-145 cells for 72 h

RT-PCR检测多烯紫杉醇与奥曲肽联合用药24 h 对DU145细胞VEGFAmRNA﹑Caspase9mRNA﹑ Caspase3 mRNA及ABCB1 mRNA表达的影响。结 果见图 5~8，其中A图为PCR电泳结果图，B图为数 据统计图。

A: the result of PCR electrophoresis;M: marker;1.control;2.OCT （100nM）;3.OCT（100nM）/DTX（10nM）;4.DTX（10nM） B: statistics;*:P<0.05,compared with OCT(100)group;▲▲:P<0.01 ,compared with OCT(100)group，DTX(10)group 图 5 多烯紫杉醇与奥曲肽联合用药作用于DU145细胞24 h VEGFAmRNA的表达 Figure 5 Expression of VEGFA mRNA in DU-145 cells after docetaxel and octreotide combinaton treatment for 24h

A :M: marker;1:control;2:OCT（100nM）;3:OCT（100nM）/DTX （10nM）;4:DTX（10nM） B: ▲▲:P<0.01,compared with OCT(100)group，DTX(10)group 图 6 多烯紫杉醇与奥曲肽联合用药作用于DU145细胞 24 h Caspase9 mRNA的表达 Figure 6 Expression of Caspase 9 mRNA in DU-145 cells after docetaxel and octreotide combinaton treatment for 24h

A:M:marker；1:control； 2:OCT（100nM）；3:OCT（100nM） /DTX（10nM）；4:DTX（10nM） B:*:P<0.05,compared with OCT(100)group；▲:P<0.05,compared with OCT(100)group,DTX(10)group 图 7 多烯紫杉醇与奥曲肽联合用药作用于DU145细胞24 h Caspase3mRNA的表达 Figure 7 Expression of Caspase3 mRNA in DU-145 cells after docetaxel and octreotide combinaton treatment for24h

A :control（×200）; B:OCT（100nM）（×200）;C:OCT（100nM）/ DTX（10nM）（×200）;D:DTX（10nM）（×200） 图 8 多烯紫杉醇与奥曲肽联合用药作用于DU145对细胞迁移的影响 Figure 8 Effects of docetaxel and octreotide combinaton on cell migration of DU-145 cells

VEGFAmRNA的相对表达量由图 5可以观察 到联合用药组与对照组﹑100 nM OCT组﹑10 nM DTX组[(0.50±0.04) vs.(0.87±0.02)﹑(0.72±0.03)﹑ (0.78±0.03) ；（P﹤0.01）]相比表达下降，单独用 药组与对照组相比表达有下降（P﹤0.05），其 中100 nM OCT组的表达低于10 nM DTX组（P﹤ 0.05）；如图 6所示各组均有Caspase9mRNA的表 达，联合用药组与对照组﹑100 nM OCT组﹑10 nM DTX组[(0.90±0.06) vs.(0.53±0.03)﹑(0.55±0.04)﹑ (0.51±0.04)；（P﹤0.01）]相比表达升高；各组均 有Caspase3 mRNA的表达，联合用药组与对照组﹑ 100 nM OCT组﹑10 nM DTX组[(0.97±0.01) vs.(0.80 ±0.01)﹑(0.88±0.01)﹑(0.94±0.00)；（P﹤0.05）]相 比相对表达量升高。其中10nM DTX组的表达高于 100nM奥曲肽组（P﹤0.05），药物处理组均高于 对照组（P﹤0.05），见图 7。ABCB1 mRNA的表 达相互之间没有差异。 2.3 多烯紫杉醇与奥曲肽对细胞迁移的影响

由图 8可以观察到，A图为对照组细胞，划痕 区几乎愈合；B图OCT（100nM）组和D图DTX （10nM）组划痕区均有细胞迁移，迁移距离均 小于对照组，C图为OCT（100 nM）/ DTX（10 nM）组细胞几乎没有迁移。结果表明两种药物均 能抑制细胞的迁移能力，联合用药时抑制作用最大。 3 讨论

多烯紫杉醇诱导细胞凋亡主要通过增大Bcl-2 磷酸化水平，下调Bcl-xL蛋白表达水平，诱导p53和 抗血管生成因子的生成^[2]。此外凋亡还和特定基因 的表 达有关，如半胱氨酸酶（Caspases）家族。

Caspase家族以非活性酶原存在，被激活后， 可以有序地引起各种Caspases参与下游细胞蛋白的 连锁反应，引起细胞凋亡。实验组中细胞随着DTX 药物浓度的增加，细胞形态发生变化：细胞变圆﹑ 脱落﹑胞质中出现空泡及胞膜皱缩等凋亡典型改 变。并且浓度越高，时间越长，变化越明显。这从 形态学上证实了多烯紫杉醇对DU145细胞的抑制作 用。我们同时采用MTT法证实了DTX对人前列腺 癌的抑制作用具有时间和剂量依赖性。

生长抑素（somatostatin，SST）是十四肽类抑 制剂，具有多种分泌作用并参与多种细胞活动， 包括抑制细胞分泌和增殖。这些细胞功能的实现 是通过SST与6个G蛋白偶联受体（SSTR1，2A， 2B，3，4和5）结合介导。SST作用的靶目标均 表达不同亚型的SSTRs^[3]。多项体外实验证实SST 与SSTRs之间连接具有特异性。所有的受体亚型 （SSTR1-5）都介导细胞抑制作用，而SSTR2和 SSTR5可以介导细胞凋亡。人类前列腺癌DU145 细胞表达SSTR2和SSTR5。因此SSTRs可能成为治 疗前列腺癌的潜在靶点。大量研究表明，SST及其 类似物对多种实体瘤具有抑制作用，如胃癌﹑结 肠癌﹑胰腺癌﹑肺癌﹑肝癌﹑前列腺癌等^[4]。这种 抑制作用与SST诱导的肿瘤细胞凋亡有关^[5]，并且 SST及其类似物与其他化疗药物联合应用时可以增 强多种肿瘤细胞对药物的敏感度^[6]。

奥曲肽（OCT）是人工合成的八肽SST类似 物，与SSTR2和SSTR5亚型受体具有较高的亲和 力。本实验发现不同浓度奥曲肽对细胞均具有一 定抑制作用，抑制作用非常小，没有剂量依赖 性，显微镜下观察细胞凋亡不明显。但是随着时 间延长，细胞抑制作用增大，并且差异具有统计 学意义。OCT对细胞的抑制作用具有时间依赖 性。本实验使用的OCT是临床用药，采用不同稀 释倍数处理细胞，实验使用的药物浓度受限于药 物本身最大浓度。稀释的最大浓度是0.5×10⁵ nM。 此时培养细胞72 h，可以观察到部分细胞有明显 的凋亡形态改变。我们推测，随着细胞浓度的增 大，细胞凋亡会增加。

DTX是目前已知能够明显延长难治性前列腺 癌生存时间的药物，但是其临床应用非常有限。 DTX临床应用易产生耐药性，大部分患者经过 DTX治疗后出现转移，并且DTX细胞毒性强，除 了作用于肿瘤细胞也作用于正常细胞。这种不具 有选择性的药物作用导致临床应用产生广泛的不 良反应。血液系统不良反应有白细胞减少。神经 毒性主要表现在四肢末梢麻木，并随着用药浓度 的升高而加剧。此外还有严重的过敏反应等。而 OCT在临床上应用非常广泛，不良反应少^[1]。关键 一点OCT和高表达SSTR2、SSTR5受体的前列腺癌 细胞结合，靶向作用于癌细胞。本实验目的在于 DTX与OCT联合应用于细胞，一方面减少DTX的 用药剂量，降低不良反应和细胞耐药性，另一方 面通过OCT靶向作用癌细胞提高药物疗效。MTT 结果显示OCT能够明显增加DTX对DU145细胞的 敏感度。

细胞凋亡是受基因调控的细胞自主启动的程 序性死亡方式，是一种非常复杂病理和生理过 程。近年来许多研究证实肿瘤的发生与凋亡密切 相关。研究肿瘤细胞凋亡有可能为临床治疗肿瘤 提供依据。实验研究表明所有动物细胞凋亡机制 类似，其中Caspase家族在凋亡中具有重要作用。 Caspase3是凋亡启动蛋白^[7]。活化的Caspase3既 可以激活下游底物Caspase3﹑Caspase9，共同降 解底物，也可以直接降解底物，如降解DNA，使 其片段化等^[8]。本实验发现联合用药组Caspase3 mRNA和Caspase9 mRNA表达均升高，单独用 药组Caspase9 mRNA表达无变化，单独用药组 Caspase3 mRNA表达有差异，DTX组高于OCT组 （P < 0.05），提示联合用药可能激活Caspase3和 Caspase9促进细胞启动凋亡机制。

恶性肿瘤最大的特点是转移和扩散，对肿瘤 患者危害极大。肿瘤转移的首要条件是血管生 成，是肿瘤生物学行为的重要因素^[9]。VEGFA是 重要的血管生成因子，可以刺激内皮细胞增殖、 迁移和增强血管通透性。目前VEGFA被认为是特 异性高、作用最强的血管生成因子^[10]。VEGFA主 要是通过与VEGER1和VEGFR2特异性结合，受 体磷酸化激活胞内信号转导通路发挥作用^[11]。最 新的实验显示VEGFA还可以促进人淋巴血管内皮 细胞的迁移和增生^[12]。多种肿瘤包括前列腺癌高 表达VEGFA^[13]，在胃癌﹑乳腺癌^[14]中发现VEGFA 的表达和肿瘤的转移有关。本实验初步证实了 VEGFA表达的变化和前列腺癌DU145细胞的迁移 正相关。DTX及OCT部分抑制VEGFA的表达， OCT的抑制作用大于DTX的抑制作用，差异有统 计学意义。OCT(100)/DTX(10)组抑制作用增强。 实验结果表明OCT(100)/DTX(10)对细胞迁移抑制 作用增强可能和VEGFA的表达有关。

我们在同样条件下检测了耐药基因ABCB1的 表达，各组间无差异。ABCB1是药物代谢转运通 路中蛋白，在多药耐药中起主导作用。实验证实 联合用药对耐药基因ABCB1的表达没有影响。

目前DTX是治疗前列腺癌的一线药，能够有 效延长患者的寿命，但是延长时间有限。奥曲 肽具有靶向抑制肿瘤细胞的作用，两者联合用 药，可以降低多烯紫杉醇的剂量，减少不良反应 及增大杀伤作用。但是奥曲肽作用于表达SSTR2 与SSTR3的靶细胞才能发挥抑制作用和促凋亡作 用。多烯紫杉醇与奥曲肽联合处理细胞能否应用 于临床仍需要进一步研究。