AKT在正常卵巢组织和癌组织中激活水平的 显著差异提示其在肿瘤发生发展中的重要作用。 本文前期研究发现，上皮性卵巢癌中AKT异常激 活不仅是上游PI3K分子异常激活的后续效应， 同时与AKT基因自身扩增密切相关。既往研究表 明，AKT异常激活可促进卵巢癌细胞增殖，抑制细胞凋亡。但AKT异常激活对卵巢癌细胞的运动 和侵袭的影响及相关机制，仍有待深入探讨。本 研究中，构建了外源性AKT1基因真核表达质粒和 靶向AKT1基因的shRNA质粒，采用脂质体介导的 方法，分别转染SKOV3细胞，观察细胞转染前后 p-AKT表达水平的变化，检测其对细胞侵袭和迁 移等生物学行为的影响及机制。 1 材料与方法 1.1 材料

上皮性卵巢癌细胞株SKOV3购自ATCC。鼠 抗人磷酸化AKT（Ser473）单克隆抗体、兔抗人 AKT多克隆抗体、兔、鼠抗人GAPDH单克隆抗体 均购自美国Cell Signal公司。TRIZOL、RT-PCR试 剂盒购自美国Invitrogen公司。培养液及胎牛血清 购自美国GIBICO公司。RT-PCR试剂及限制性内 切酶盒购自Fermentas公司。质粒抽提试剂盒购自 美国QIAGEN公司。Lipofectamine™2000购自美国 Invitrogene公司。 1.2 构建pEF6/Myc-AKT1质粒

根据GeneBank中AKT1基因序列（收录号： NM0332300），应用Primer5.0软件设计引物， 在5’端和3’端引物加上BamHⅠ、 XbaⅠ酶切位 点。扩增AKT1反义核酸引物序列为：上游引 物：5’-GGA TCC ATG AAG ACG GAG CGG CCC CG-3’，下游引物：5’-TCT AGA TCA GGC CGT CGC GCT GGG CG-3。以SKOV3 cDNA模板进行 高保真PCR扩增，扩增片段1 443 bp。产物经酶 切、回收、纯化后与载体片段 pEF6/Myc-His A酶 切片段相连，再次经酶切、回收、纯化后转化感 受态体菌DH5α。摇菌后进行质粒抽提、鉴定，获 得导入AKT1基因全长cDNA的质粒。 1.3 构建短发卡式RNA-AKT1质粒（shRNAAKT1）

参照siRNA的设计原则，在 AKT1(序列号: NM033230)的编码序列中，设计19~21 nt的DNA片 段，并利用BLAST进行查询，确定其为特异性序 列。阴性对照选取国际通用的non-target siRNA。 根据选定的siRNA序列合成两条模板单链，每条单 链均包括该基因的正义链和反义链，中间以9个脱 氧核苷酸的Loop结构相连，后面续接RNA PollyⅢ 聚合酶转录终止位点，同时模板链两端分别设计 BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的内切酶位点。产物经酶切、 回收、纯化后与双酶切的线化pRNA质粒载体相 连，再次经酶切、回收、纯化后转化感受态体菌 DH5α。摇菌后进行质粒抽提、鉴定，-20℃保存 待用。 1.4 重组质粒转染SKOV3细胞

SKOV3细胞以2.5×10⁶/孔的密度接种至6孔 板，待细胞汇聚率达到90%左右，按照推荐剂量 准备质粒-Lipofectamine^TM2000复合物，加入到培 养孔中，分为实验组(含目的基因质粒转染组)、阴 性对照组(空质粒转染组或含non-target shRNA转染 组)、空白对照组(未转染组)。在转染后6 h改换含 10%胎牛血清的DMEM高糖培养液。 1.5 Transwell小室检测细胞的侵袭能力

Matrigel(50 mg/L)按1:8稀释，包被Transwell 小室底部，4℃过夜；上室加入200 μl含0.5%BSA 的DMEM培养液，水化基底膜，37℃ 30 min，加 入含5×10³个细胞悬液200 μl；下室加入800 μl 5% FBS培养液；在37℃、5%CO₂培养箱培养24 h； PBS淋洗，并用棉签擦去微孔膜上层的细胞，95% 乙醇室温固定20 min后，苏木精染色10 min，1% 盐酸酒精分化，自来水淋洗；电子显微镜观察、 拍照、计数5个高倍视野（×200）下穿过滤膜的细 胞数，取其平均值。各组细胞穿过Transwell的数 量作为比较细胞侵袭能力的指标。实验重复3次。 1.6 划痕试验检测细胞的迁移能力

在12孔板接种细胞5×10⁵/孔，设置3复孔；待 细胞密度达到90%时，用10 μl的枪头做垂直划痕； PBS洗涤3次以去除细胞碎片；加入含5% FBS的培 养基，在37℃、5%CO₂培养箱培养，不同时间点 （0，24，48h）显微镜下观察细胞向划痕区的生 长情况并拍照，测量各组细胞任意三个部位的不 同伤口的宽度，相对运动率=[W(t=0 h)－W(t=24 h，48 h)]/W(t=0 h)，计数三次实验的平均值，作为 评价细胞迁移能力的指标。 1.7 Western blot分析总AKT和磷酸化AKT的蛋白 表达水平

细胞经无血清培养24 h同步化后，加入含10% 血清的培养液刺激2 h后，弃去上清液，PBS淋 洗，甩干，RIPA提取总蛋白并BCA法测定蛋白水 平。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，稳定电流270 mA在4℃90 min转移到硝酸纤维素膜上，放入5% 封闭液中，室温摇床振荡2 h，单克隆鼠抗人磷 酸化AKT (Ser473)(1:500)，或单克隆兔抗人AKT (1:1 000)以及内参GAPDH (1:5 000)的封闭液，赶 尽气泡，用封口机封口，4℃过夜。PBST轻轻漂 洗15 min×3次；将膜转入另一杂交袋中，加入荧 光二抗，室温避光孵育1 h (1:3000)，应用LI-COR Odyssey Infrared Imaging System扫描检测。得出的 IOD值经内参GAPDH校正后进行统计学分析。 1.8 RT-PCR分析AKT激活对MMP-2、MMP-9、 uPA、CXCR4和VEGF mRNA表达水平的影响

依据试剂盒步骤进行提取总RNA。引物由上 海生工合成。AKT1上游引物为5’-TCT ATG GCG CTG AGA TTG TG-3’，下游引物为5’- CTT AAT GTG CCC GTC CTT GT-3’(合成片段 112bp，退 火温度59℃)；VEGF上游引物为5’-GC TCT ACC TCC ACC ATG CCA-3’，下游引物为5’-AGC TCA TCT CTC CTA TGT GC-3’(合成片段 320bp，退 火温度51.5℃)；CXCR4上游引物为5’-TCT CGG TCC ACT CTT GTT-3’，下游引物为5’-GCC ACT CAG GAG GAT TAC-3’(合成片段362bp，退火温度 60℃)；MMP-2上游引物为5’-CAT AGG ATG TGC CCT GGA AG-3’，下游引物为5’-TGG TCC TGG TTG TAG AAG GG-3’(合成片段 427bp，退火温 度58.5℃)。MMP-9上游引物为5’- GGA TGG GAA GTA CTG GCG ATT-3’，下游引物为5’-CAC TTG GTC CAC CTG GTT CAA-3’(合成片段543bp，退 火温度59℃)。uPA上游引物为5’-CGG AAT TCC AGC AAC GAA CTT-3’，下游引物为5’-GAT CCG CTA GCT TTC AGT CTG-3’(合成片段376bp，退火 温度55℃)。GAPDH上游引物为5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’，下游引物为5’- GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’ (合成片段 220bp，退火 温度50~60℃)。各样本PCR产物通过1.2%琼脂糖凝 胶电泳后，应用凝胶成像扫描及分析系统，用各 样本的目的基因条带灰度值与相应GAPDH条带灰 度值相比，求其比值。 1.9 统计学方法

应用SPSS11.5软件进行统计分析，实验数据 以均数±标准差（±s）表示。用Excel软件作图， 采用单因素方差分析及χ²检验，P<0.05为有差异 具有统计学意义。 2 结果 2.1 重组质粒对上皮性卵巢癌SKOV3细胞中 AKT1 mRNA表达和蛋白激活水平的调节

RT-PCR法检测转染前后AKT1 mRNA表达水 平的变化，分别以未转染组细胞和阴性对照组细 胞为对照。外源性pEF-1α-AKT可明显上调AKT1 mRNA转录水平；而shRNA表达质粒可显著抑制 AKT1mRNA表达，差异有统计学意义（P=0.029； P=0.032），见图 1A。Western blot检测转染前 后AKT总蛋白和磷酸化AKT表达水平的变化与 mRNA变化水平是一致的，见图 1B。

A:RT-PCR determined the transfective effi ciency in SKOV3 cells on AKT1 mRNA level;B:Western blot determined the transfective effi ciency in SKOV3 cells by detecting the activity of AKT;1: SKOV3 cells;2:SKOV3/Negative cells;3:SKOV3/pRNAT-AKT cells;4:SKOV3 cells;5:SKOV3/pEF- 1α cells;6:SKOV3/pEF-1α-AKT cells;*:P=0.029,P=0.032,compared with control group and the negative control group,respectively,n=3 in each group;**:P=0.0065,P=0.0049 compared with control group and negative control group,respectively,n=3 in each group; take GAPDH as control 图 1 RT-PCR、Western blot检测质粒转染前后SKOV3细胞中AKT1 mRNA、AKT总蛋白和磷酸化AKT表达水平 Figure 1 RT-PCR and Western blot were used to determine transfective effi ciency in SKOV3 cells by detecting the expression of AKT mRNA level and activity of AKT respectively

Transwell小室培养24 h，上调AKT基因后 SKOV3/pEF1-α-AKT细胞穿透Matrigel包被膜的 细胞数（132.92±7.32）显著多于SKOV3/pEF1-α 细胞（60.34±5.23）和未转染SKOV3细胞（57.97± 6.73）的穿透数，差异均有统计学意义（P=0.037， P=0.034），见图 2A。相反，下调AKT1基因 Transwell小室培养24h，SKOV3/pRNAT-AKT1细胞 穿透Matrigel包被膜的细胞数（20.21±3.89）显著少 于阴性对照SKOV3/Negative细胞（62.34±4.23）和 未转染SKOV3细胞（57.97±6.73）的穿透数，均有统 计学意义（P=0.018；P=0.025），见图 2B。

A:Transwell assay showed upregulation AKT enhanced SKOV3 cells’ invasion;B:Transwell assay showed AKT siRNA inhibited SKOV3 cells’ invasion（hematoxylin-staining ×200,A *:P=0.037,P=0.034,compared with the control group and the negative control group,respectively,n=3 in each group;B*:P=0.018; P=0.025,compared with the control group and the negative control group,respectively,n=3 in each group 图 2 Transwell小室检测质粒转染前后对SKOV3细胞侵袭能力的影响 Figure 2 Transwell assay detected the effect of AKT regulation on the invasion of SKOV3 cells

划痕后培养24 h，相对于未转染质的空白细胞 组和和阴性对照细胞组，SKOV3/pEF1-α-AKT细 胞明显向划痕处迁移；划痕48 h，SKOV3/pEF1-α- AKT细胞的划痕基本修复，见图 3A。外源性AKT 可促进SKOV3细胞的迁移。反之，在划痕培养48 h时，SKOV3/pRNAT-AKT细胞的划痕明显宽于未 转染SKOV3细胞和SKOV3/Negative细胞的划痕， 从而提示AKT1基因干扰抑制SKOV3细胞迁移，见 图 3。

A:wound healing assay showed upregulation AKT increased cell migration rate in SKOV3 cells;B:wound healing assay showed downregulation AKT decreased cell migration rate in SKOV3 cells. A**:P=0.0061,P=0.0078,compared with the control group and the negative control group,respectively, n=3 in each group;B**:P=0.0053,P=0.0058,compared with the control group and the negative control group,respectively,n=3 in each group 图 3 划痕实验检测AKT基因对SKOV3细胞迁移能力的影响 Figure 3 Wound healing assay detected the effect of AKT regulation on the migration rate of SKOV3 cells

为探讨可能的调控机制，RT-PCR分析侵袭 及迁移相关分子变化。上调AKT可促进MMP-2、 uPA、VEGF和CXCR4 mRNA表达，反之下调AKT 则抑制MMP-2、uPA、VEGF和CXCR4 mRNA表 达水平。但对MMP-9 mRNA表达水平的影响不明 显，见图 4。

1:SKOV3 cells;2:SKOV3/pEF-1α cells;3: SKOV3/pEF-1α-AKT cells;4:SKOV3 cell;5: SKOV3/Negative cells;6:SKOV3/pRNATAKT cells;MMP-2matrix metalloproteinase-2 MMP-9 matrix metalloproteinase-9uPA human urokinase plasminogen activator VEGF vascular endothelial growth factor CXCR4 chemokine (C-X-C motif) receptor 4 图 4 RT-PCR检测AKT基因对SKOV3 细胞中MMP-2、MMP-9、uPA、VEGF 和CXCR4 mRNA表达水平的影响 Figure 4 RT-PCR analysis determined the transfective efficiency in SKOV3 cells and changes of CXCR4,VEGF, MMP-2,MMP-9 and uPA at mRNA level

本文通过构建AKT1表达质粒和AKT shRNA 调控AKT的mRNA水平，发现相同培养条件下， 相对于空白细胞组和阴性对照组，转染细胞组的 AKT磷酸化水平发生了相应的调节。

肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是肿瘤细胞转移 潜能的体现。Transwell-Matrigel法是用来检测细胞 侵袭的量化分析模型。划痕实验粗略反映了细胞 的迁移能力。本研究显示，shRNA干扰细胞后， 细胞侵袭和迁移能力下降超过50%；反之，外源性 AKT1转染SKOV3细胞后，细胞侵袭和迁移能力增 强，从而说明AKT基因在卵巢癌中可调控细胞的 侵袭和迁移能力，AKT基因磷酸化水平越高，则 细胞越容易浸润周围组织乃至远处转移。

至于AKT基因对癌细胞侵袭和转移的调控机 制，以往研究发现，PI3K/AKT信号通路可通过激 活mTOR以及其下游核糖体蛋白p70S6K，促进肌 动蛋白的细丝重构，促进细胞运动^[1]；AKT可上调 NF-κB的转录活性，增加肿瘤细胞的引动功能，有 助于癌细胞侵袭^[2]；PI3K/AKT信号通路可上调基 质金属蛋白酶-2（MMP-2）^[3]、MMP-9^[4]mRNA和 蛋白质表达，降解细胞外基质促进肿瘤细胞的转 移。 本研究采用RT-PCR法检测了一系列与侵袭或 转移相关分子的mRNA水平变化，研究结果与以 往的研究结果有不同之处。

MMPs和uPA被认定是对肿瘤细胞本身的增 殖和生长所必不可少的，同时也是与肿瘤侵袭转 移密切相关的两套系统。本研究显示，转染外 源性AKT1的SKOV3细胞比阴性对照组细胞表达 MMP-2和uPA的水平明显升高，但MMP-9未见显 著增加；反之，shRNA靶向抑制AKT1基因显著 下调MMP-2和uPA的表达水平，但MMP-9未见显 著改变，提示AKT1基因可能通过调控MMP-2和 uPA，影响其对基质的降解，从而调控肿瘤的侵袭 和转移。尽管本研究显示，AKT对MMP-9的表达 影响不明显，但不排除组织特异性的差异，今后 将通过检测多种卵巢癌细胞株来进一步证实。

CXCR4是趋化因子SDF-1α配体^[5]。Hashimoto 等^[6]研究认为SDF-1α/CXCR4轴异常是导致胃癌 腹腔转移机制之一，阻断CXCR4不仅抑制细胞 转移，同时抑制mTOR激活，诱导细胞自噬。本 研究发现，AKT1基因亦可能通过调控VEGF、 CXCR4，影响各自信号传递，从而控制卵巢癌细 胞的侵袭和转移，但具体的调控网络仍需进一步 深入。

综上，AKT信号通路可能通过调控MMP-2、 uPA、CXCR4、VEGF转录参与上皮性卵巢癌细胞 的侵袭和转移。因此，靶向AKT可深入探讨恶性 肿瘤的表型调控机制，为肿瘤治疗筛选有效靶位。