流行病学研究发现，长期服用非甾体类抗炎 药（non-steroidal anti-infl ammatory drugs,NSAIDs） 可减少结直肠癌、食管癌、胃癌和胰腺癌等消化 道肿瘤的危险性^[1]，NSAIDs对胃肠道肿瘤有一定 的化学预防作用。大量实验证据表明，诱导凋亡和 影响细胞生长周期是NSAIDs以环氧合酶或非环氧 合酶介导途径预防肿瘤的主要方式，其中以凋亡 作用最显著。许多研究发现，NSAIDs 抗肿瘤作用 主要通过抑制COX-2表达，抑制前列腺素产物活 性或数量，引起凋亡蛋白和抗凋亡蛋白变化，最终 诱导细胞凋亡增加而实现的，这是COX-2介导的凋 亡途径。近年的研究结合我们的前期实验发现p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen act ivated protein kinase,p38MAPK) 信号通路的下游底物环氧合 酶-2( cycloox ygenase-2,COX-2)具有调节表达的作 用^[2]。在此基础之上,我们推测p38MAPK 可能通过 COX-2 在上游参与抑制肿瘤细胞的生长。为了进 一步探讨戊地昔布诱导结肠癌细胞凋亡的可能机 制,本研究在以往研究的基础上探讨其机制,为戊地 昔布应用于结肠癌的治疗提供实验性理论依据。 1 资料与方法 1.1 材料

人HT-29细胞购自上海中科院细胞中心。 DMEM/F12培养液为Gibco公司产品。兔抗cleaved caspase-3、p38 MAPK、p-p38 MAPK为美国Cell signaling公司产品。小鼠抗Bax单克隆抗体，兔抗 Bcl-2、caspase-3多克隆抗体以及ECL增强化学发 光试剂盒为美国Santa Cruz公司产品。Valdecoxib 由上海辉瑞生物科技有限公司合成，纯度99% ,用 0.5%羧甲基纤维素钠溶解。辣根酶标记羊抗小鼠或兔IgG购自北京中杉金桥公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养和分组刺激实验

以含体积分数 0.1胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 u/ml青 霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM-F12（3:1）培养 液常规培养细胞。待HT-29达75%~85%融合后，用 无血清培养液同步24 h。同步后的细胞分成3组： 正常组（C）、药物处理组（V）及溶剂对照组 (S)。刺激48 h后收集细胞观察。 1.2.2 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡

采用 Annexin V-PI双染法检测Valdecoxib干预48 h后 HT-29细胞凋亡变化。收集上清液及贴壁细胞，用 PBS洗2 次，以1 ml结合缓冲液重新悬浮细胞,使其 浓度为1×10⁶ 、100 μl的细胞悬液加入5 ml流式管 中,每管加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl 20 μg/ml的 碘化丙啶避光15 min，流式细胞仪观察。 1.2.3 Western blot检测

细胞用冰冷PBS洗2遍， 加入细胞裂解液（25 mmol/L Tris-HCL，10 mmol/L EDTA，体积分数0.01 NP-40,150 mmol/L氯化钠，质 量浓度1 g/L苯甲基磺酰氟），冰浴2 h，4℃、12 000 r/min离心20 min，Lowry法测定上清液蛋白浓度。 细胞裂解蛋白40 μg，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰 胺（SDS-PAGE）凝胶电泳后电转移至PVDF膜； 质量分数0.05的脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，分别 加入caspase-3、cleaved caspase-3、p38 MAPK、 p-p38 MAPK、Bax、Bcl-2抗体，4℃过夜，洗膜 后加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或兔抗体， 37℃孵育2 h；洗膜后加ECL试剂，ODYSSEY远 红外双色荧光成像系统显影（USA，LI.COR Gene Company）。用美国UVP公司LabWorks 4.5分析系 统软件对Western blot条带进行定量分析。 1.3 统计学方法

实验数据以x±s表示，采用SPSS13.0统计软 件进行统计，组间比较采用单因素方差分析，以 P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 Valdecoxib对HT-29细胞凋亡的影响

正常组（C）、溶剂对照组(S) 及药物处理组 (V)，其HT-29细胞凋亡率分别为（3.6±0.5）、（3.86± 0.4）、（24.4±0.8），与正常组相比，Valdecoxib干预 HT-29细胞凋亡率，差异有统计学意义（P<0.01)，见 图 1。此外，溶剂对细胞凋亡无明显影响。

图 1 戊地昔布诱导HT-29细胞凋亡的影响 (n=6) Figure 1 Effects of Valdecoxib on apoptosis of human colon cancer cell line HT-29 (n=6)

与C组（0.2±0.13）相比，戊地昔布干预能够显 著增加cleaved caspase-3表达（0.69±0.08）和Bax/ Bcl-2比率（0.89±0.07）(P<0.05)，见图 2、3。此外， 溶剂组（0.26±0.11）对HT-29细胞cleaved caspase-3 表达和Bax/Bcl-2比率无明显影响(P>0.05)。

图 2 戊地昔布对HT-29细胞cleaved caspase-3、caspase-3 的影响 (n=6) Figure 2 Effects of Valdecoxib on activation of cleaved caspase-3 and caspase-3 in human colon cancer cell line HT-29 (n=6)

图 3 Valdecoxib对HT-29细胞Bax和Bcl-2的影响 (n=6) Figure 3 Effects of Valdecoxib on activation of Bax and Bcl-2 in human colon cancer cell line HT-29 (n=6)

在干预48 h后，与C组（0.12±0.09）相比，V 组p38 MAPK的磷酸化水平明显升高（0.78±0.03） （P<0.01）；与SB组（Valdecoxib干预的同时加入p38 MAPK抑制剂SB30580）（0.26±0.11）相比， Valdecoxib干预组p38 MAPK磷酸化水平明显升高 （0.78±0.03）(P<0.05)，见图 4。溶剂组（0.13± 0.05）与正常对照组相比，p38 MAPK磷酸化水平 差异无统计学意义 (P>0.05)。

图 4 Valdecoxib对HT-29细胞p38 MAPK活化的影响 (n=6) Figure 4 Effects of Valdecoxib on activation of p38 MAPK in human colon cancer cell HT-29 (n=6)

既往的研究已证实，长期服用NSAIDs的人群 中,结肠癌的发病率明显下降，提示NSAIDs对结 肠癌具有一定的化学预防作用，其中抑制COX-2 被认为是主要途径。因此，调节COX-2有可能成 为有效的治疗结肠癌的靶点^[3]。最近研究^[4]发现 NSAIDs除了抑制COX以外，还能抑制胃癌MAPKs 信号通路转导所必需的磷酸化蛋白激酶，从而抑制肿瘤细胞增生。研究^[5]也认为IL-1β诱导COX-2 表达是由P38和P42/44途径介导的。以上结果表明 尽管COX-2在NSAIDs抗肿瘤作用中至关重要，但 仍存在不涉及COX-2的信号调节途径发挥抑癌作 用。提示NSAIDs促进肿瘤细胞凋亡部分可能存在 与抑制COX-2以外的途径有关。

p38蛋白激酶为丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员， 是一个重要的信号分子。研究表明，p38 MAPK信 号通路可能与胃肠道肿瘤有关^[6]。前期研究也表 明^[2]，p38MAPK 在结肠癌细胞凋亡中的作用及与 COX-2 的关系。以上说明，P38 MAPK信号通路 可能与HT-29细胞凋亡密切相关。本研究结果表明, COX-2选择性抑制剂Valdecoxib能够激活p38MAPK 且使其表达增高，采用SB203580阻断p38MAPK通路 能够抑制细胞凋亡、cleaved caspase-3表达和Bax/Bcl-2 比率。以上说明，p38MAPK信号通路可能与HT-29细 胞凋亡密切相关。Liu等^[7]研究发现Valdecoxib通过 P38MAPK诱导食管癌Eca109细胞凋亡，同时上调Fas 和 FasL的表达。在人结肠癌细胞HT-29凋亡过程中, P38MAPK激活并抑制survivin的表达^[8]。

综上所述，Valdecoxib诱导HT-29细胞凋亡， 这种作用可能部分是通过P38MAPK信号通路的活 化实现的，这为进一步探讨NSAIDs的抗肿瘤作用 机制及指导临床用药提供重要依据。