赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）是由曲 霉菌属和青霉菌属的某些菌株产生的一种真菌毒 素，其污染非常普遍，广泛存在于小麦、玉米、 豆类等粮食作物以及咖啡、葡萄酒、啤酒、面包 等食品中^{[1, 2, 3]}。目前体外研究已经发现OTA具有肾 毒性、肝毒性、神经毒性、免疫毒性等生物学效 应，OTA可以抑制人肾小管上皮细胞的生长^[4]、诱 导肝细胞DNA的氧化应激损伤^[5]、损伤海马神经元 细胞^[6]、扰乱胃肠道黏膜屏障、破坏胃肠道黏膜细 胞间的紧密连接和信息传递^[7]、抑制体外培养的T 和B淋巴细胞增殖，并且可以减少IL-2和IL-2受体 的产生^[8]。此外，动物实验还发现，OTA具有致畸 性、致突变性和致癌性，如孕鼠灌喂OTA后可以 引起胎鼠脑积水、小眼畸型、肾发育不全^[9]；长期 食用OTA污染的饲料，可以诱发F344/N大鼠出现 肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、前胃上皮细胞增生、乳腺 纤维腺瘤等^[10]。1993年国际癌症研究中心将OTA 列为“可能的人类致癌物”^[11]。

河北省赞皇县是我国胃癌高发区之一，胃癌 年均死亡率超过59/10万^{[12, 13]}。2006年，我们对 当地居民粮食中OTA的污染状况进行了现场调 查，发现当地居民食用的小麦中OTA的检出率为 45.16%，平均含量为2.41 μg/kg，明显高于国内 其他地区的检测结果（我国六省区OTA平均污染 浓度0.60 μg/kg），而且当地居民OTA的日暴露量 （1.17 μg/kg）明显高于世界卫生组织/粮农组织联 合专家委员会（joint FAO/WHO rxpert vommittee on good sdditives,JECFA）暂定的每周容许摄入 量（100 ng/kg）^[14]。鉴于OTA在胃癌高发区粮食 中的高污染以及对人类的可能致癌性，使得探 讨OTA与胃癌发生的可能关系变得非常重要。因 此本部分研究首先利用微核试验初步观察OTA对 GES-1细胞染色体的损伤情况；接着利用染色体核 型分析进一步观察OTA作用后GES-1细胞染色体的 畸变情况，为揭示OTA暴露与人胃黏膜损伤乃至 胃癌发生的可能关系提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料

永生化人胃黏膜上皮细胞（GES-1）购自北 京肿瘤研究所；OTA购自德国ALEXIS公司，用甲 醇（色谱纯）将其溶解，配制成10 g/L的储存液， 4℃保存，临用时稀释；DMEM培养液购自美国 Gibco公司；新生牛血清购自四季青公司；秋水仙 碱购自上海化学试剂厂；冰乙酸购自天津市化学 试剂三厂；甲醇购自天津市凯通化学试剂公司； 胰蛋白酶购自美国Sigma公司。 1.2 实验分组

取对数生长期GES-1细胞，随机分组，实验组 给予OTA，使其终浓度分别为5、10、20 μmol/L； 同时设溶剂对照组（甲醇，终浓度为0.08%）。各 组细胞处理后继续培养24 h，然后收集进行微核试 验和染色体核型分析。 1.3 微核试验检测OTA对GES-1细胞微核率的影响

5、10 、20 μmol/L OTA处理GES-1细胞24 h 后，胰酶消化收集细胞 ，1500 r/ min 离心5 min， 细胞沉淀用 0.075 mol/ L KCl 低渗液处理，然后 用3:1甲醇冰醋酸固定液固定3次，最后用少量固 定液将细胞沉淀制成悬液，滴2滴于冰冻的洁净玻 片上，室温下自然干燥，用吉姆萨（Giemsa）染 色，光学显微镜下观察，在双盲条件下计数1 000 个细胞中含有微核的细胞数，微核率（%）=含微 核细胞数/观察的细胞总数×100%。 1.4 染色体核型分析检测OTA对GES-1细胞有丝分裂中期染色体核型的影响

不同浓度OTA处理GES-1细胞24 h后，加入秋 水仙素（终浓度为0.05 μg/ml），继续培养3 h，1 000 r/min离心10 min收集细胞，吸上清液，逐滴加入 预热至37℃的 KCl (0.075 mol/L)，轻轻混匀，37℃ 水浴孵育40 min，新鲜固定液（3:1甲醇冰醋酸） 固定。取冷冻的载玻片，距玻片15 cm高度处向玻 片滴1～2 滴细胞悬液，于75℃烤箱中，烤片3 h。 Giemsa染色，中性树胶封片。每组选择100个染色 体分散良好、形态清晰的中期分裂相，油镜下观 察、记录染色体数目、染色体形态异常（如：双 着丝粒、间隙、断裂、环状）等染色体畸变类型 及频度，并与溶剂对照组比较。 1.5 统计学方法

数据采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理， 以P<0.05为差异有统计学意义。微核实验数据用 （x±s）表示，进行单因素方差分析（ANOVA）， 对所测定结果进行正态性及方差齐性检验。染色 体畸变率各组之间的比较采用χ²检验。 2 结果 2.1 OTA对GES-1细胞微核率的影响

光学显微镜下可见GES-1细胞呈圆形，胞核 和胞质显色清楚。对照组细胞很少出现微核[微核 率为（1.23±0.27）%]，见图1 A；随着OTA处理浓 度的增加，出现微核的细胞数逐渐增多，见图 1B、 1C、1D。随着OTA处理浓度的增加，GES-1细胞微 核率逐渐增加，其中10 μmol/L和20 μmol/L OTA处 理组的细胞微核率分别为（2.90±0.54）% 和（3.84± 1.06）%，明显高于溶剂对照组[（1.23±0.27）%， P<0.05]，提示OTA处理可以诱导GES-1细胞染色 体的损伤。

图 1赫曲霉毒素A诱导GES-1细胞微核形成 Figure 1Induction of micronucleus by OTA in GES-1 cells

GES-1细胞经5、10和20 μmol/L OTA处理24 h 后，结构异常的染色体与溶剂对照组相比明显增 多，尤其以20 μmol/L OTA处理组增多明显。其 中，染色体结构异常（间隙、断裂、缺失、环状染 色体）的发生率随OTA处理浓度的增加而增多,见 图 2。5、10和20 μmol/L OTA处理组染色体总畸变 率分别为14%、20%和24%，明显高于溶剂对照组 （4%,P<0.05），见表 1。而且还发现，在20 μmol/L OTA处理组中，一个细胞有丝分裂中期的染色体 可以同时发生两种或三种畸变。该结果进一步证 实OTA处理可以诱导GES-1细胞染色体畸变。

不同浓度OTA处理24 h后GES-1细胞中期分裂 相出现的双着丝粒、间隙、断裂、环状等异常染 色体结构，见图 2。

图 2OTA对GES-1细胞有丝分裂中期染色体核型的影响 Figure 2Effects of OTA on metaphase chromosome karyotype in GES-1 cells

表1(Table 1)

表1 染色体核型分析检测OTA对GES-1细胞有丝分裂中期染色体核型的影响 (%) Table 1Effects of OTA on frequencies of chromosome aberrations in GES-1 cells detected by metaphase chromosome karyotype analysis (%)

表1 染色体核型分析检测OTA对GES-1细胞有丝分裂中期染色体核型的影响 (%) Table 1Effects of OTA on frequencies of chromosome aberrations in GES-1 cells detected by metaphase chromosome karyotype analysis (%)

前期研究中发现OTA可以诱导GES-1细胞发生 氧化DNA双链损伤以及细胞周期紊乱^{[15, 16]}。DNA 被认为是致癌性物质攻击的主要靶分子，而DNA 双链断裂是最严重的DNA损伤形式，它能够使细 胞的正常生命活动乃至生存都受到严重威胁，是 发生基因突变、染色体断裂的主要原因之一。因 为断裂DNA双链如果未被修复或进行了不恰当修 复，可能会导致染色体缺失、重排、转位和倒置 等现象，进而基因组会发生不稳定，易于形成肿 瘤^[17]。研究表明，很多致癌物，包括致癌性真菌 毒素都可以引起细胞DNA损伤以及染色体畸变： 致癌性细菌幽门螺旋杆菌可以诱导细胞发生DNA 损伤以及染色体畸变^[18]；黄曲霉毒素能够诱导啮 齿类动物和人类细胞染色体畸变，染色体的姐妹染 色单体互换，染色体断裂等^[19]。

已有研究发现：OTA可以诱导大鼠肾细胞微 核形成^[20]；同时OTA诱导的染色体畸变可能和巴 尔干肾病的发生有关^[21]。但目前有关OTA对人胃 黏膜上皮细胞染色体影响的研究国内外未见报 道。本研究采用微核试验和染色体核型分析深入 探讨了不同浓度OTA处理对GES-1细胞染色体的影 响。微核试验结果发现，在0~20 μmol/L的浓度范 围内，随着OTA处理浓度的增加GES-1细胞微核形 成率逐渐增加，尤其以10和20 μmol/L OTA处理组 细胞微核形成率增加明显，提示OTA处理可以诱 导GES-1细胞染色体的损伤。微核试验虽然操作快 速、简便，但这种试验方法有其局限性，只能间 接反映染色体的损伤程度，并不能直观的观察染 色体的损伤类型。我们采用染色体核型分析进一 步观察了OTA对GES-1细胞染色体畸变率的影响, 结果发现GES-1细胞经不同剂量OTA处理后，各种 类型的畸变染色体（双着丝粒染色体、染色体间 隙、染色体断裂、环状染色体和多倍体）的发生 率均较溶剂对照组有所增加，较大剂量OTA处理 后GES-1细胞染色体总畸变率明显增多。综上可见 OTA可以增加GES-1细胞微核的形成，诱导GES-1 细胞染色体发生畸变。

近来有学者通过大样本调查研究发现，人外周 血淋巴细胞的微核发生率可以预测癌症发生的风 险，因此微核被认为是细胞癌变的早期事件^[22]。而 染色体畸变则被认为是肿瘤发生的一个重要因素。 染色体在畸变过程中会发生染色体重排和基因扩 增，进而使细胞发生癌变。Gandhi等^[23]认为人乳头 状甲状腺癌的发生是由于某一特定位点的染色体发 生易位而形成的。de Klein等^[24]认为9号染色体易位 可以使癌基因异常激活，从而导致慢性粒细胞白血 病的发生。本研究结果发现OTA可以增加人胃黏膜 上皮细胞的微核发生率，同时导致细胞染色体出现 各种类型的畸变。研究结果表明OTA可能会通过导 致人胃黏膜上皮细胞染色体畸变，进而使细胞发生 恶性转化。因此，我们认为粮食中OTA的高污染可 能会对胃癌高发区居民胃癌的发生发挥一定作用， 这应当引起肿瘤防治工作者的重视。本研究加深 了对OTA生物效应的认识，为OTA暴露的合理处置 奠定了科学基础，为胃癌的合理防治提供了科学依 据，对提高我国农村居民，特别是胃癌高发区居民 食品安全水平具有重要意义。