乳腺癌的致癌机制可能是多步骤、多因素、 多基因协同或单独作用于机体不同阶段的复杂过 程，在正常情况下，机体存在多种原癌基因并参 与细胞的生长、增殖、分化以及信号转导，但在 异常情况下，当原癌基因非正常表达或过表达则 会导致相应的细胞增殖分化异常甚至成为克隆性生长的肿瘤细胞。而由原癌基因c-fms编码的集落 刺激因子CSF-1的受体CSF-1R的过度表达对乳腺 癌肿瘤的发生、发展起很重要的作用^[1]。

CSF-1是体内重要的细胞因子，在进行造血 细胞体外研究中，它可刺激不同的造血干细胞在 半固体培养液中形成细胞，在体外实验中对骨髓 和脾巨噬细胞系有刺激作用^[2]。而集落刺激因子 CSF-1受体是c-fms基因编码的产物，它是一种酪 氨酸激酶受体，当它与其配体CSF-1结合后会激活 受体酪氨酸激酶信号系统，并使酪氨酸激酶的活 性持续升高，从而改变效应器的生物活性，使相 应的细胞持续生长增殖，并且对细胞还发挥长时 效的作用，最后分化发生癌变^{[3, 4]}。

本研究拟通过建立乳腺癌荷瘤鼠动物模型， 探讨CSF-1及其受体对乳腺癌荷瘤鼠肿瘤的作用 及对免疫器官脾和骨髓的影响。实验检测小鼠肿 瘤的体积大小变化，探其相关基因的表达，以及 检测鼠肿瘤、脾脏和骨髓细胞的增殖生长活性， 对鼠的胸腺、脾和淋巴结的细胞进行表型分析鉴 定，从而更加全面地研究探讨CSF-1及受体对乳腺 癌荷瘤鼠肿瘤的生长和机体免疫的作用。 1 材料与方法 1.1 材料

Balb/c小鼠，雌性，250~300 g，由中国人民 解放军军事医学研究院实验动物中心提供；4T1 细胞购自中国医学科学院肿瘤医院；Trizol，DNA marker购自北京普博欣生物科技公司 ；RPMI 1640 培养液购自美国Gibco公司；GAPDH，引物由美 国Invitrogen公司合成；一步法RT-PCR试剂盒购 自美国Bioer公司；MTT试剂购自天津润泰科技有 限公司；CSF-1（rM-CSF）购自美国Peprotech 公 司；CSF-1受体(CSF1R/MCSF Receptor)购自北京 义翘神州生物技术有限公司(Sino Biological Inc.)。 1.2 方法 1.2.1 RT-PCR

RT-PCR技术是目前用于对提取的目标RNA进 行反转录的方法。本实验设计了如下的引物分别 对小鼠脾细胞进行反转录实验，测定CSF-1作用后 细胞相关目的基因mRNA的表达，见表 1。 反应参数：50℃反转录30 min，94℃预热5 min后，94℃ 30 s，47℃ 30 s，72℃ 3 min，循环 40次，72℃延伸5 min。用Originpro8.5软件处理 数据，以引物因子为横坐标，以所测OD值为纵坐 标，获得相关函数，绘制标准曲线。

表 1(Table 1)

表 1 相关目标基因RT-PCR的引物序列 Table 1 RT-PCR associated primer sequences of target gene

表 1 相关目标基因RT-PCR的引物序列 Table 1 RT-PCR associated primer sequences of target gene

利用MTT比色法测定免疫器官包括脾细胞 和骨髓细胞，及其肿瘤细胞对刺激物CSF-1的反 应，进而来推断细胞增殖活性功能的变化。用 Originpro8.5软件来处理数据，绘制曲线。 1.2.3 动物实验

在无菌条件下，为对照组(A组)和实验组(B组) 左侧腋下注射1×10⁷浓度的4T1细胞悬液建立荷瘤 鼠模型，于注射后第7天成瘤，并检测小鼠的成瘤 率。在瘤体出现的第4天为实验组小鼠注射CSF-1 及其受体，每天注射rM-CSF 3~4 ml (200 ng/ml)； CSF1R/MCSF Receptor 50×10⁴~100×104IU/次连 续2天，对照组小鼠注射相同剂量的0.9%氯化钠溶 液。从成瘤的第1天开始，记录肿瘤长径（L）和短 径（W），每天早中晚各一次取其平均值，用Steel 公式：V=LW²/2计算肿瘤的体积。于成瘤后第8天 断颈法处死小鼠取出肿瘤、骨髓和脾脏，做细胞实 验，将对照组与实验组的三种标本（脾，骨髓，肿 瘤）的新鲜细胞分于两份，第一份以Trizol法提取 总RNA，做RT-PCR和电泳，第二份培养24 h，做 MTT实验。目的在于测定CSF-1及其受体刺激后目 的mRNA的表达变化和各成分细胞活性增殖情况。 1.3 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量数据 以均数±标准差(x±s)，多个样本均数多重比较采用 方差分析及SNK-q检验，以双侧检验P＜0.05为差 异有统计学意义。 2 结果 2.1 动物实验结果

术后同期放化疗组生存率明显高于单纯放射 在未作用CSF-1及其受体的前三天内，实验组 的肿瘤体积增长速度为0.0357，对照组的增长速度 为0.0374，两者相比差异无统计学意义（P>0.05）， 而CSF-1及其受体作用后实验组肿瘤增长速度为 0.0216，对照组的增长速度为0.0091，实验组是 对照组的2.4倍，两组相比差异有统计学意义（P ＜0.05），见图1。

图 1CSF-1及其受体对肿瘤体积的影响 Figure 1Effects of CSF-1 and its receptor on tumor volume

用MTT实验检测CSF-1及其受体作用后荷 瘤鼠肿瘤细胞、脾细胞及骨髓细胞的增殖生长 活性。实验首先在1×10⁶的细胞浓度下进行细胞 培养，为了验证不同浓度的细胞数目是否会对 MTT的结果有影响，我们又用1×10⁵的细胞进行 实验，检测各细胞活性。结果为在1×10⁵浓度下， 实验组肿瘤细胞、脾细胞及骨髓细胞的活性均高 于对照组，由统计学分析得出其相对比分别为 （99.54±3.12）%、（142.84±6.94）%、（105.42 ±5.35）%（P<0.05），其相对值倍数分别为2.0、 2.4、2.1，结果均具有统计学意义。在1×106浓度 下，实验组上述三种细胞活性同样均高于对照 组，由统计学分析得其相对比分别为（128.89± 2.02）%、（118.82±2.57）%、（68.12±7.65）% （P<0.05），其相对值倍数为2.3、2.2、1.7，结果 具有明显的统计学意义。因此MTT实验结果表明 CSF-1及其受体作用后小鼠的肿瘤细胞增殖活跃， 同时脾细胞、骨髓细胞都有增殖活性升高的表 现，见表 2、图 2。

表 2(Table 2)

表 2 小鼠MTT实验细胞活性检测（x±s,%） Table 2 Proliferation of mice tumor and lymphocyte detected by MTT assay（x±s,%）

表 2 小鼠MTT实验细胞活性检测（x±s,%） Table 2 Proliferation of mice tumor and lymphocyte detected by MTT assay（x±s,%）

图 2MTT实验检测细胞增殖活性的结果 Figure 2Cell proliferation activity determined by MTT test

为了研究CSF-1及其受体对荷瘤鼠肿瘤生长的 影响，我们收集了未治疗荷瘤小鼠的肿瘤细胞提 取其RNA做对照，测定CSF-1及其受体治疗后荷瘤 鼠肿瘤细胞的c-fms、Fra-1及c-Fos等分子的mRNA 表达情况。由RT-PCR电泳结果可见在实验组中 c-fms、Fra-1、c-Fos的mRNA表达量都不同程度地 高于相应对照组。从电泳结果可看出，与对照组相 比实验组小鼠肿瘤细胞中与CSF-1相关的癌基因表 达水平均有不同程度的变化。c-fms、Fra-1及c-Fos 的表达量有所增加，促进了肿瘤增长，见图 3。

图 3RT-PCR检测肿瘤细胞内不同基因的mRNA表达结果 分析 (灰度值,x±s) Figure 3Comparison of mRNA expression in tumor cells between two groups detected by RT-PCR (gray value,x±s)

为了进一步从数量及功能变化方面了解相关 免疫细胞在荷瘤前后表达的变化，我们采用半定 量RT-PCR技术检测了一些关于免疫抑制相关分 子的mRNA在荷瘤小鼠胸腺、脾脏及淋巴结中的 表达情况，从而推断出相关免疫细胞分泌免疫抑 制性细胞因子的能力。检测的目的分子包括核内 的转录因子Foxp3、表面分子CD152、CD127及分 泌产物TGF-β、IL-10等。从电泳结果可看出，无 论在胸腺、脾脏或淋巴结中，肿瘤组小鼠体内目 的基因表达水平均有不同程度的变化。具体表现 为与对照组相比，实验组CD127表达量下降，而 Foxp3、CD152、TGF-β、IL-10的表达量有所增 加，这表明荷瘤小鼠体内抑制活性的免疫细胞数 量增加，可以推测，在荷瘤小鼠体内，免疫细胞 表现抑制能力增强，CSF-1及其受体治疗后荷瘤鼠 的免疫细胞增值活跃，发挥更强大的免疫抑制功 能，促进了肿瘤增长，见图 4。

图 4RT-PCR检测不同免疫器官中细胞因子及表面分子mRNA表达结果分析(灰度值,x±s) Figure 4Comparison of mRNA expression of cytokines and surface molecules in deferent immune organs between two groups detected by RT-PCR (gray value,x±s)

CSF-1不仅能选择性刺激巨噬细胞集落形成，诱 导巨噬细胞的增殖分化，而且在许多肿瘤的发生、 发展过程中也扮演重要的角色^[5]。通过动物实验检测 CSF-1及其受体对荷瘤鼠肿瘤体积的影响，发现CSF-1 及其受体作用能够加快荷瘤鼠肿瘤的体积增长。

我们便从细胞水平探求原因，发现与正常荷 瘤小鼠相比，实验组荷瘤鼠的肿瘤细胞、脾脏细 胞、骨髓细胞的增殖水平均呈现升高的状态。肿 瘤细胞的增殖活跃是理解范围之内的，由于脾 脏、骨髓部位的淋巴细胞是机体免疫的主要效应 细胞，它的增殖功能在一定程度上反应了机体的 免疫功能状态。因此，促进肿瘤增长结果说明 CSF-1及其受体治疗后荷瘤鼠的整体免疫功能是低 下的。

本实验用RT-PCR分别检测了肿瘤细胞与 CSF-1相关的癌基因表达，结果显示c-fms、 Fra-1、c-Fos的mRNA表达量都不同程度高表达， 这一结果与动物实验结果吻合。RT-PCR的另一 部分结果提示：无论在胸腺、脾脏或是淋巴结 中，肿瘤组小鼠体内的目的基因的表达水平均有 不同程度的变化。其中，CD127表达量下降，而 Foxp3、CD152、TGF-β、IL-10的表达量有所增 加。CD127^low低提示抑制性CD4+CD25+调节性T 细胞的分泌产物TGF-β、IL-10的mRNA表达量上 升，而CD4⁺CD25⁺调节性T细胞功能的发挥有赖 于这两种细胞因子，同时Foxp3及CD152也影响着 CD4+CD25+调节性T细胞功能的发挥，它们的基因 表达水平上调，表明CD4+CD25+调节性T细胞的功 能增强，导致机体免疫功能低下，免疫系统对肿 瘤免疫应答降低，有利于肿瘤耐受的形成，促进 肿瘤的发生和发展。换言之，CSF-1及其受体治疗 后荷瘤鼠的免疫细胞增殖活跃，发挥更强大的免 疫抑制功能，促进了肿瘤增长。

CSF-1作为炎症介质分子，结合于膜受体， 受体二聚化引发磷酸化，进而激活下游通路，如 Ras、MAPK和PI3K等，使M-CSF效力于肿瘤的侵 袭和生长，在乳腺癌预后不良的病例中也出现了 较高比例的M-CSF和M-CSFR的过表达^[6]。总之， 我们确定CSF-1及其受体促进荷瘤鼠的抑制表型 的免疫细胞增殖活跃，发挥更强大的免疫抑制功 能，从而促进了肿瘤增长^[7]。

此次试验结果证实CSF-1及其受体会促进乳 腺癌肿瘤的增长，进一步支持了阻断CSF-1/ CSF- 1R(c-fms)则可以抑制肿瘤生长的观点，这也是肿 瘤免疫抑制机制的一部分。通过阻断CSF-1/ CSF- 1R(c-fms)来逆转抑制性免疫细胞诱导的免疫耐 受，为提高抗肿瘤治疗效果开辟了新途径^[8]。由此 可以设想用c-fms基因疫苗可以预防并阻止乳腺癌 肿瘤增长，并能够进一步开展针对性肿瘤免疫治 疗的新技术，以原癌基因为肿瘤免疫的靶点构建 基因疫苗，挖掘肿瘤免疫治疗的潜在价值。