近年来，随着一些涉及肿瘤浸润、转移及血管 新生特异性靶点的发现，肿瘤靶向治疗的研究成为 肿瘤研究的新热点，肿瘤靶向药物以其高效低毒的 特性，必将成为今后肿瘤化疗药物开发的趋势。短 肽CTT是由Koivunen等^[1]于1999年利用噬菌体展示 技术筛选出来的针对MMP-2、MMP-9的特异性阻 断剂。研究表明，MMP-2、MMP-9在多种恶性肿 瘤中呈现高表达，与肿瘤侵袭、转移及肿瘤脉管生 成密切相关^{[2, 3, 4]}，是抗肿瘤转移的理想靶点。短肽 CTT不但在肿瘤浸润转移方面有很好的抑瘤效果， 而且也表现出良好的肿瘤靶向性^{[1, 5, 6]}，预示着CTT 在抗肿瘤药物开发、靶向带药或肿瘤显像方面有良 好的应用前景。但目前的研究也发现CTT在应用方 面存在一些问题：（1）CTT主要由疏水性氨基酸 构成，因而水溶性较差^{[7, 8, 9]}；（2）CTT只有10个氨 基酸，体内稳定性较差，容易被降解^{[9, 10, 11]}。随着对 短肽CTT结构和效能关系研究的逐步深入，对其分 子结构进行适当改造、改善理化性质和药代动力学 性质，增强抗肿瘤效果，以利于其在药物开发方面 的应用，成为短肽CTT应用研究的热点。

RGD三肽序列是目前倍受关注的功能肽片 段，是细胞外基质中各种粘连蛋白共同含有的一 个保守三肽，它可与细胞膜上的整合素相互识 别，从而介导细胞与细胞外基质之间的黏附^[12]。 国内外学者发现外源性RGD肽可竞争性封闭肿瘤 细胞的整合素与ECM结合，从而阻断肿瘤细胞与 ECM的黏附及其信号转导通路，进一步抑制肿瘤细 胞的增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡^{[13, 14, 15]}。此外，外源 性RGD肽还可下调MMP-2、MMP-9的表达和分泌， 抑制肿瘤细胞对基质蛋白的水解，从而抑制肿瘤的 侵袭和转移^{[16, 17]}。因RGD序列肽具有上述的抗肿瘤 活性，而且其中精氨酸R、天冬氨酸D均为极性氨基 酸，若将其用于CTT的结构改造，对提高CTT的水 溶性和稳定性，增强抗肿瘤功能都有重要的意义。 基于以上背景，本研究对短肽CTT的结构进行 设计改良，在其氨基端接上一段极性氨基酸序列 （RGDSY-），其中引入RGD三肽，得到双靶向抗肿瘤 的CTT衍生肽RGDSY-CTT，希望能提高短肽的水溶 性和稳定性，并获得更强的抗肿瘤效果，为开发更有 效的肽类抗肿瘤靶向治疗药物提供实验理论依据。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株

乳腺癌MCF-7细胞株由广州医学 院实验中心提供。 1.1.2 肽段合成

参照文献^{[1, 5]}，本研究自行设 计十五肽：RGDSYC*TTHWGFTLC*，由广州杰 特伟公司合成，并同时合成C*TTHWGFTLC*及 STTHWGFTLS作为对照肽，*为二硫键氧化成环 部位，上述多肽均经高压液相色谱仪（HPLC）及 质谱分析确认。 1.1.3 主要试剂

BCA蛋白定量试剂盒购自 凯基生物公司； Ⅳ 型胶原酶 （ 主要成分为 MMP-2、MMP-9）购自美国Gibco公司；酪蛋 白（β-casein）购自美国Sigma 公司；纤连蛋 白（Fn）购自美国CHEMICON公司；Costar Transwell TM培养板（3422）购自美国Corning公 司；MTT购自Sigma公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养

MCF-7采用RPMI 1640培养液(含 10%胎牛血清)37℃、5%CO2培养箱常规培养，细胞 长至80%~90%，0.25%胰酶消化，按1:3传代。 1.2.2 多肽溶液配置

多肽以PBS配成溶液，过滤 除菌，－20℃保存。 1.2.3 酪蛋白(β-casein)水解抑制实验

实验设7 组，第一组为最大水解组：Ⅳ型胶原酶(80 μg /ml) 及底物β-casein(1.25 μg/ml)；第二组为无水解组： 只有底物β-casein(1.25 μg/ml)；第三至第七组为 实验组：除胶原酶和β-casein外分别加入250、500 μg/ml RGDSY-CTT； 250、500 μg /ml CTT；500 μg/ml STT。37℃孵育1 h，加入5×蛋白质上样缓冲 液(PH6.8Tris-cl60 mmol/l，甘油25%，SDS 5%， 溴酚篮0.1%）混合后上样于12%聚丙烯酰胺凝胶 （12%分离胶，4%积层胶）每孔20 μl，进行连续SDS-PAGE电泳，积层胶 80V 30 min，分离胶200V 90 min。0.25%考马斯亮蓝染色2 h，脱色过夜。凝 胶电泳结果用Iamgemaster进行拍照，采用Quantity one软件密度扫描分析。重复3次，取平均灰度 值，计算酪蛋白水解抑制率。 1.2.4 短肽溶解度检测

精确称取CTT及RGDSYCTT 各0.25、0.5、1.0、2.0 mg分别溶于0.5 ml蒸馏 水，溶解条件参见我国《药典》凡例2000年版： 置于(25±2)℃环境，每隔5 min摇床振荡30 s，观察 30 min。待其充分溶解后，2 000 r/min离心2 min， 取上清液，BCA法测蛋白浓度。每个蛋白梯度样 品做3个复孔，用酶标仪测定562 nm波长的吸光度 值，取平均值。绘制标准曲线，查得相应蛋白含 量，计算蛋白浓度。 1.2.5 细胞黏附实验

以Fn（10 μg/ml）每孔50 μl 包被96孔板，1%BSA100 μl封闭2 h，接种指数生长 期的MCF-7细胞约5×10⁴细胞/孔。实验设实验组、 空白对照组（细胞+培液）和空白调零组（只加培 液）。实验组CTT、RGDSY-CTT、STT分别设终浓 度为50、100、200 μg/ml共9组，细胞37℃孵育2 h， 弃培养液，PBS洗涤3次。每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），孵育4 h，弃上清液，每孔再加入200 μl DMSO，摇床振荡20 min至MTT结晶溶解，酶标分 析仪490 nm测吸光度值。实验每组重复6次。 1.2.6 细胞迁移实验

以Fn（10 μg/ml）每孔50 μl 涂布Transwell小室滤膜下表面。接种指数生长期 的MCF-7细胞于Transwell小室上室每孔100 μl（约 1×10⁵细胞），下室加入NIH/3T3细胞培养上清 液600 μl。实验设实验组和空白对照组，实验组 CTT、RGDSY-CTT、STT分别设终浓度为100、 200 μg/ml共6组。37℃孵育12 h后，用棉签擦去 滤膜上层未穿膜的肿瘤细胞，滤膜经甲醛固定30 min，伊红染色，200倍显微镜下计数上下左右中5 个视野的穿膜细胞数。实验每组重复5次。 1.3 统计学方法

采用SPSS12.0统计分析软件建立数据库，进 行统计分析。计数资料的统计描述用x±s表示，多 组均数的比较采用单因素方差分析。P＜0.01为差 异有统计学意义。 2 结果 2.1 酪蛋白水解抑制实验

灰度值扫描显示RGDSY-CTT、CTT对Ⅳ型胶 原酶的抑制作用明显，浓度为250 μg/ml时RGDSYCTT 和CTT抑制率约为53.6%和77.7%；高浓度500 μg/ml时，两者抑制率相近，分别为94.6%和 96.9%；高浓度500 μg /ml时，STT抑制效率仅有 11.6%，见图 1。

图 1 酪蛋白水解抑制实验 Figure 1 β-casein hydrolyzation and inhibition assay

由BCA法检测结果绘制标准曲线查得相应蛋白 含量见图 2,计算各组样品蛋白浓度得到：CTT的溶 解度约为745 μg/ml，RGDSY-CTT四个检测组均完 全溶解，溶液未饱和，最高检测浓度为4 030 μg/ml。

图 2 蛋白定量BCA 法检测短肽溶液蛋白含量 Figure 2 Quantity of peptides was detected by BCA

RGDSY-CTT在终浓度为50、100、200 μg/ml时， MCF-7细胞的黏附率依次为：85.1%、74.1%、 63.8%，随着浓度升高，黏附率降低(P＜0.01)； RGDSY-CTT在三种浓度对MCF-7细胞黏附能力的 抑制作用均比CTT强(P＜0.01)；CTT与STT在各浓 度下对MCF-7细胞黏附能力的影响与空白对照相比 差异均无统计学意义(P＞0.05)，见图 3。

图 3 短肽处理2h对MCF-7细胞黏附的影响 Figure 3 Cellular adhesion capability of MCF-7 by peptides after 2h

RGDSY-CTT在100和200 μg/ml时对MCF-7细 胞的迁移能力抑制率分别为42.9%和60.8%； CTT 在100和200 μg/ml时对MCF-7细胞的迁移能力抑 制率分别为39.2%和57.0%；RGDSY-CTT比CTT对 MCF-7细胞的迁移能力抑制作用更明显(P＜0.05)， 见图 4。

图 4 短肽对MCF-7细胞迁移的抑制作用 Figure 4 The inhibition of celler migration capability of MCF-7 by peptides

环肽CTT能特异性抑制MMP-2和MMP-9， 对其他基质金属蛋白酶家族成员无明显影响^{[1, 7]}， 在开发以MMP-2、MMP-9为靶点的抗肿瘤药物方面展现了良好的应用前景。对环肽CTT进行结 构改造或是化学修饰，改善其理化性质，增加 生物利用度以及增强其抗肿瘤功能，是CTT在抗 肿瘤转移应用研究方面的重要内容。本研究从改 善CTT水溶性，增加其稳定性，同时增强其抗肿 瘤能力的目的出发，以环肽CTT为基础，引入含 RGD功能基团的极性氨基酸序列（RGDSY-）， 将RGDSY序列中酪氨酸Y的自由羧基与环肽CTT 第一个氨基酸半胱氨酸C的自由氨基以肽键连接而 成，得到新肽RGDSY-CTT。新肽中加入的极性氨 基酸序列（RGDSY-）含有RGD序列肽，能以整合 素α_vβ₃为靶点阻断肿瘤细胞与基质或基底膜之间黏 附，这将使新肽RGDSY-CTT具有更优的理化特性 以及双靶点抗肿瘤功能。

短肽CTT由10个氨基酸构成，其中两个半胱氨 酸（C）二硫键缩合形成胱氨酸极难溶于水，且色 氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸（W、G、F、 L） 均为侧链疏水氨基酸，具有很强的疏水性。药 物溶解度直接影响药物在体内的吸收与药物生物 利用度，因此CTT的水溶性差在一定程度上限制了 它作为药物的开发和应用。目前常用的改善肽类药 物水溶性的方法有：（1）增加极性亲水氨基酸构 成比例^{[18, 19]}；（2）通过高亲水性分子化学修饰等 ^{[20, 21]}。本研究中设计的新肽RGDSY-CTT，引入了 极性氨基酸序列（RGDSY-），序列中含有四个极 性氨基酸（R、D、S、Y），增加了极性氨基酸在 肽构成中的比例，据Swiss Institute of Bioinformatics 建立的专业蛋白质分析系统EXPASY评估其亲水性 能比CTT有显著提高。而参照《药典》凡例2000版 检测药物溶解度的条件，将RGDSY-CTT与CTT分 别溶于蒸馏水中，通过蛋白定量BCA法测得CTT的 饱和溶解度约为745 μg /ml，而RGDSY-CTT溶解度 在4 030 μg/ml以上（实验中最高检测浓度至4 030 μg/ml），表明了引入极性氨基酸序列（RGDSY-） 对改善CTT的水溶性有显著效果。

短肽CTT是由10个氨基酸组成的小分子肽， 体内稳定性差，容易降解，这也是小分子活性肽 在应用中普遍会遇到的问题。为克服这一缺点， 目前常采用的改造方式有：（1）在小分子肽中掺 入非天然氨基酸^{[22, 23]}；（2）增加肽的长度，一般 认为12肽以上有助增加肽的刚性，减少降解^[9]。本 研究设计的新肽RGDSY-CTT为15肽，这将在一定 程度上有助于增加短肽的刚性；当然，肽分子越 大，免疫原性也会越大，因此增加的氨基酸序列 也不宜过长^[9]。

新肽RGDSY-CTT的理化特性更优于CTT，有 利于增加其生物利用度，然而这种设计是否会影 响短肽的功能基团，从而影响其活性，是评价本 次改造成败的关键。本研究通过酪蛋白水解抑制 实验检测RGDSY-CTT抑制MMP-2、MMP-9水解 底物酪蛋白的能力，结果显示RGDSY-CTT、CTT 对MMP-2、MMP-9的抑制作用明显，在浓度为250 μg/ml时，RGDSY-CTT抑制率约为53.6%，低 于CTT的抑制率77.7%；而在高浓度500 μg /ml时， 两者抑制率相近，分别为94.6%和96.9 %。低浓 度时RGDSY-CTT抑制效率比CTT低，是由于前者 分子量较大，相同质量浓度所带的抑酶功能基团 较少，这一比率与两者质量摩尔比基本一致。在 高浓度时，两者功能基团与酶作用接近饱和，因 此两者的抑制效率也都接近于完全抑制。由此可 见，新肽RGDSY-CTT所加的极性氨基酸序列并未 影响短肽抑制 MMP-2、MMP-9的活性。

新肽RGDSY-CTT引入了RGD功能序列，从 结构组成上除了具有抑制MMP-2、MMP-9的活 性，还可阻断肿瘤细胞整合素α_vβ₃对细胞外基质的 黏附，使其具有了针对整合素为靶点的抗肿瘤活 性。本研究把MCF-7细胞种植于涂布Fn的孔板， 与短肽共孵育2 h后，检测其对MCF-7细胞黏附能 力的影响，结果显示随着RGDSY-CTT浓度升高， MCF-7细胞的黏附率明显降低，而CTT各浓度组黏 附率均未见明显下降。这说明新肽RGDSY-CTT具 有抗肿瘤细胞黏附作用，而且这种活性主要来自 于引入的RGD片段，而并非环肽CTT所原有的。 此外，通过细胞迁移试验观察短肽对MCF-7细胞 迁移的影响，结果显示相同浓度下RGDSY-CTT对 MCF-7细胞迁移的抑制能力比CTT更强(P＜0.05)。 这一结果表明新肽RGDSY-CTT能通过RGD片段 抑制MCF-7细胞的黏附作用而影响其运动迁移能 力，从而增强其抗肿瘤浸润和转移的效果。

综上所述，本研究设计合成的新肽RGDSYCTT 有更优于CTT的理化特性且具有CTT及RGD两 个功能基团，可作用于不同的抗肿瘤靶点，在开 发靶向抗肿瘤药物或肿瘤显像方面都将具有更好 的应用前景。