基础研究发现唑来膦酸对多种肿瘤有直接 或间接的抗肿瘤作用^{[1, 2, 3]}，包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、降低肿瘤细胞的迁移、侵袭能 力，抑制肿瘤新生血管形成等。在鼻咽癌细胞系 HNE-1，已有体外研究证明唑来膦酸可以抑制其 侵袭、迁移能力^[4]，但对其增殖及凋亡作用未见报 道。本研究通过体外试验，观察唑来膦酸对人鼻 咽癌细胞株HNE-1增殖抑制及凋亡诱导作用并探 索相关机制，为临床治疗提供基础理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂

唑来膦酸(瑞士Novartis公司)，Trizol (美国Invitrogen公司)，SYBR® Green Ex Taq™ 试剂 盒(日本TaKaRa公司)，细胞凋亡检测试剂盒(南京 凯基公司)，TUNEL试剂盒(德国罗氏公司)，兔抗 人Bcl-2、Bad、Bax、Caspase-9、GAPDH多克隆 抗体(北京博奥森公司)。1.1.2 细胞株

人鼻咽癌细胞株HNE-1由中南大 学肿瘤研究所提供，细胞培养用含15%胎牛血清、 100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养 液，于37℃、95%湿度、5%CO2条件下进行培养。1.2 实验方法 1.2.1 MTT法检测

取对数生长期HNE1细胞，按 每孔2×10³个细胞种植于96孔板，以不同浓度（0、 2.5、5、10、20、40 μmol/L）唑来膦酸分别作用 24、48、72 h后，每孔加入浓度为5 g/L的MTT 20 μl，继续培养4 h，加入150 μl 二甲基亚砜，待MTT 结晶充分溶解后，应用酶标光度仪测定各孔492 nm 的A值，计算唑来膦酸对细胞的增殖抑制率。增殖 抑制率=（1－A实验组/A对照组）×100%。根据MTT结果 筛选出唑来膦酸的最佳处理剂量组，分为4组，即 对照组、10、20和40 μmol/L处理组。 1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡

药物作用48及72 h，用0.25%胰蛋白酶常规消化，收集1×10⁵个细胞， 500 μl Binding buffer悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-FITC混匀后加入5 μl Propidium Iodide，室温避光 5 min，在1 h用内流式细胞仪检测细胞凋亡。 1.2.3 流式细胞术检测细胞周期

药物作用48 h， 常规消化，加入预冷的70%乙醇4 ml悬浮细胞，加 入PI染液400 μl(含0.25 mg/ml RNase A)，室温避光 30 min，用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。 1.2.4 原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling ,TUNEL)检测凋亡细胞片段化

收集细胞，固定、脱水、浸蜡制成细胞团石蜡块，4μm 厚连续切片，脱蜡、水化后按TUNEL试剂盒说 明书操作。显微镜下(×400)随机计数上下左右中5 个不同视野的凋亡细胞数及总细胞数，计算凋亡 率。凋亡率=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。 1.2.5 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定Bcl-2、 Bax、Bad和Caspase-9 mRNA的表达

药物作用48h后，以Trizol液提取细胞总RNA，取1 μg用于反转 录，产物用于反转录PCR扩增。目的基因Bcl-2上 游引物为5'-CTC CCT CTC CCC GCG ACT CC-3' ， 下游引物为5'-GGG GGT GTC TTC AAT CAC GCG G-3'，Bax上游引物5'-TCCAGGATCGAGCAGGG CGA-3' ，下游引物为5'-AAA AGG GCG ACA ACC CGG CC-3'，Bad上游引物为5'- GGG ATG GGG GAG GAG CCCAG-3' ，下游引物：5'- AAG GTC ACT GGG AGG GGG CG-3' ，Caspase-9上游引物为 5'-TCCCAGGGGCTGTCTACGGC-3'，下游引物为 5'-TCC AGCTGGTCGAAGGTCCTCA-3'，GAPDH 上游引物5'-ACC CAG AAG ACTGTG GATGG-3'， 下游引物为5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'。 在PCR结束后由实时荧光定量PCR仪自动绘制扩增曲 线，各组标本中目的基因mRNA表达量的检测：在反 应结束后PCR仪会自动分析给出每个标本的Ct值，应 用△△Ct法根据公式：相对表达量=2^(-△△Ct)，其中△△ Ct=△Ct_测量样本－△Ct_参照样本，△Ct=Ct_目的基因－Ct_内参基因。 1.2.6 Western blot法测定Bcl-2、Bax、Bad和Caspase-9蛋白的表达

HNE1细胞经不同浓度唑来 膦酸作用48 h后，加入适量裂解液，收集蛋白上清 液，每孔加入20 μg蛋白，变性不连续聚丙烯酰胺 凝胶电泳（SDS-PAGE），转移至PVDF膜上，加 入Bcl-2、Bax、Bad、Caspase-9和GAPDH抗体， 用辣根过氧化物酶标记的二抗检测蛋白表达。于 PVDF膜上滴加化学发光荧光增强剂显影。不做任 何处理的HNE1细胞作为对照组。 1.3 统计学方法

采用 SPSS17.0软件进行分析。用x±s表示，比 较多组样本均数用单因素方差分析,比较均数间相 差的显著性用方差分析中的Student-Newman-Keult Q 检验。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 唑来膦酸对HNE-1细胞的增殖抑制作用

与对照组比较，各处理组作用24 h后唑来膦 酸对HNE-1细胞无增殖抑制作用(P>0.05)；而作用 48 和72 h均能抑制细胞增殖，差异有统计学意义 (P<0.05)；但抑制增殖能力未呈时效和量效关系 (P>0.05)，见图 1。

图 1 不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞的增殖抑制作用 Figure 1 The anti-proliferative effect of different concentrations of Zoledronic Acid on HNE-1 cells

唑来膦酸处理HNE-1细胞48 h后，10、20、 40 μmol/L唑来膦酸组的早期凋亡率分别为（13.6 ±2.3）%、（16.2±3.42）%和（17.9±1.64）%， 与对照组凋亡率（4.2±0.1）%比较，差异有统 计学意义(P<0.05)；处理72 h后，早期凋亡率分 别为（12.9±3.6）%、（13.6±1.2）%和（27.2± 0.6）%，与对照组凋亡率（3.53±0.44）%比较， 差异有统计学意义(P<0.05)。 2.3 唑来膦酸影响HNE-1细胞周期的分布

不同浓度唑来膦酸作用HNE-1细胞48 h，S 期细胞比例较对照组升高，差异有统计学意义(P ＜0.01)，见图 2。

图 2 不同浓度唑来膦酸作用HNE-1细胞48h后细胞周期分布情况 Figure 2 Cell cycle distribution of HNE-1 cells treated with various concentrations of Zoledronic Acid for 48h

经TUNEL法染色后阳性物质呈棕褐色颗粒， 位于细胞核内。凋亡细胞多呈圆形，少数形状不 规则。各个浓度组作用HNE-1细胞48 h后的凋亡细 胞数分别为 (4.25±3.33)%、(4.45±2.56)%、(5.55± 2.87)%和(5.12±3.14)%，与对照组(3.33±4.25)%比 较差异无统计学意义(P>0.05)，作用72 h的凋亡指 数分别为(5.00±5.84)%、(11.67±3.33)%、(16.67± 5.29)% 和(26.11±4.92)% ，与对照组(5.00±5.84)% 比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图 3。

图 3 不同浓度唑来膦酸作用HNE-1细胞48及72h后的凋亡率 Figure 3 Apoptotic rates of HNE-1 cells treated with different concentrations of Zoledronic Acid for 48 and 72h

Real time-PCR和Western blot检测结果显示经唑 来膦酸处理48 h，无论是mRNA还是蛋白水平，Bax、 Bad和Caspase-9三者的表达均有不同程度的上升，而 Bcl-2表达则在高浓度唑来膦酸处理时下降，见图 4、5。

图 4 不同浓度唑来膦酸处理后HNE-1细胞Bcl-2、Bax、Bad和Caspase9 mRNA的表达 Figure 4 The mRNA expressions of Bcl-2,Bax,Bad and Caspase9 treated with different concentrations of Zoledronic Acid

图 5 不同浓度唑来膦酸处理后HNE-1细胞Bcl-2、Bax、Bad和Caspase9 蛋白的表达 Figure 5 The protein expressions of Bcl-2,Bax,Bad and Caspase9 treated with different concentrations of Zoledronic Acid

本体外实验发现唑来膦酸能抑制鼻咽癌HNE-1 细胞的增殖，诱导细胞凋亡；并进一步发现可能与 上调HNE-1细胞Bax、Bad和Caspase9 mRNA和蛋白 的表达，下调Bcl-2 mRNA和蛋白的表达有关。

本研究显示唑来膦酸对HNE-1细胞的抗增殖作 用不存在时间及浓度的依赖性。作用24 h对细胞增 殖无影响；作用48 h和72 h，浓度为10~40μmol/L 的增殖抑制率均接近50%，组间差异无统计学意 义。与文献报道唑来膦酸对乳腺癌细胞的增殖抑 制不存在浓度依赖相一致^{[5, 6]}。但在其他研究中 唑来膦酸对一些肿瘤表现出较强的抗增殖作用 并且呈时效及量效关系^{[7, 8]}。Li等^[7]报道唑来膦酸 50 μmol/L对肺癌细胞系BABB/cByJ的增殖抑制率 达80%；Ory等^[8]报道唑来膦酸对在骨肉瘤细胞系 MG63、SaOS2、U2OS和MNNG-HOS的增殖抑制 率接近90%。这可能是唑来膦酸对不同细胞系的敏 感度差异所致。

本研究发现唑来膦酸可以诱导HNE-1细胞凋亡， 并影响细胞周期的分布，这与文献报道相符^{[9, 10]}。张卫 东等^[9]报道，唑来膦酸在浓度为30 μmol/L时能诱导肺癌95D细胞凋亡，并增加G₀/G₁期的细胞比例； Iguchi等^[10]研究指出，唑来膦酸在(10~100)μmol/L 时能诱导骨肉瘤HOS细胞和MG63细胞凋亡，并明 显增加S期的细胞比例。本研究进一步探讨唑来膦 酸诱导凋亡的可能机制。

细胞凋亡通过两个途径，胞膜死亡受体介导的 外在通路及线粒体介导的内在通路。已有研究报道 唑来膦酸诱导肿瘤细胞的凋亡是通过线粒体途径 ^[11]。本研究中唑来膦酸处理后，Bcl-2家族抑制凋亡 成员如Bcl-2表达抑制，而促凋亡成员如Bax、Bad的 表达上调，且凋亡执行蛋白Caspase9 的表达上调。 提示唑来膦酸诱导HNE-1细胞凋亡可能也是通过线 粒体介导的内在通路，此结果为唑来膦酸抗鼻咽癌作用的体内抑瘤研究、抗癌机制的进一步阐明， 以及临床治疗提供一定的理论依据。但更具体的 机制，如细胞色素C的释放、线粒体膜电位的改变这 些更经典的表现等均需要进一步研究证实。